猪流行性腹泻病毒orf3基因缺失区r-pcr鉴别诊断.docxVIP

猪流行性腹泻病毒orf3基因缺失区r-pcr鉴别诊断 0 调节性免疫pedv [研究意义]猪腹泻（ped）已在欧洲和亚洲的一些养猪业发展国家进行。这是一种严重的有害传染病。最近两年来在中国部分养猪场再度爆发了以未断奶仔猪发生水样腹泻、呕吐和高死亡率为特征仔猪腹泻疫情, 该病以7日龄内仔猪发病为主, 病程急、传播迅速、仔猪死亡率高, 而且在同一猪场易呈反复发作, 曾一度造成部分猪场出现阶段性产房无仔的严重局面, 给养猪业带来了重大的经济损失。笔者在对发生仔猪腹泻疫情的临床样品检测时发现PEDV的阳性检出率很高, 推测PEDV是此次腹泻疫情主要病因之一。疫苗免疫是控制疫情的首选, 韩国、日本等已经将弱毒疫苗用于该病的预防控制, 国内也有一些猪场在使用弱毒疫苗, 在临床上如何区分疫苗免疫与自然感染毒株, 对仔猪腹泻疫情进行有效地预警具有重要意义。【前人研究进展】对于PEDV感染的诊断方法已有多种, 如对采集的临床样品进行处理后, 利用病毒适应性细胞进行病毒分离的方法;利用免疫胶体金试纸条直接检测样品中的病毒抗原;根据PEDV病毒的保守性内部基因设计引物, 利用RT-PCR的方法对病毒的基因进行检测等方法, 其中病毒分离不仅耗时耗力, 而且由于该病毒的特性难于在细胞上进行分离培养, 因此不利于对疫情及时诊断, 后两种方法可以实现对病毒的及时、快速诊断, 但是却不能很好的满足对自然感染与疫苗免疫毒株进行鉴别诊断的需求。PEDV的ORF3基因位于S基因与E基因之间, 有研究认为冠状病毒ORF3编码的辅助蛋白具有离子通道的特性与病毒的释放有关, ORF3基因沉默可以降低病毒在Vero细胞上的滴度。研究表明PEDV的ORF3基因在各毒株之间变异较大, 主要是在野毒株与细胞适应株之间存在ORF3基因缺失现象, 这一特征为开展鉴别诊断研究奠定了基础。【本研究切入点】现有的研究已经表明目前使用的PEDV弱毒疫苗均为ORF3基因存在缺失的毒株, 而能引起自然感染发病的毒株ORF3基因没有发生缺失, 基于ORF3基因缺失区域进行鉴别诊断方法的研究, 对于该病的诊断具有明显优势。【拟解决的关键问题】本研究选择PEDV的ORF3基因作为研究对象, 根据野毒株与弱毒疫苗株的ORF3基因存在缺失差异, 建立基于ORF3基因的RT-PCR鉴别诊断方法, 用于区分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫的毒株, 为仔猪腹泻疫情的发生提供快速、准确的鉴别诊断方法。 1 材料和方法 试验于2011年5月至2012年12月在中国农业科学院上海兽医研究所猪传染病研究室完成。 1.1 pedv阳性东南角腹泻样品的采集 PEDV毒株HLJ-1株和ZJCZ4株以及PRRSV (HuN4株) 、TGEV、Po RV、CFSV均由中国农业科学院上海兽医研究所猪传染病研究室分离保存, 11份已知PEDV阳性仔猪腹泻样品由中国农业科学院上海兽医研究所猪传染病研究室鉴定并保存, 26份未知仔猪腹泻样品2013年初采集自上海。 1.2 rna提取试剂盒 Taq DNA聚合酶、DNA Marker、dNTP、pMD18-T载体购自TaKaRa公司;RNA提取试剂盒RNeasy Plus Mini Kit购自QIAGEN公司;单链c DNA合成试剂盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司;感受态菌种DH5α由中国农业科学院上海兽医研究所猪传染病研究室保存。 1.3 orf3基因序列及测序 根据PEDV ZJCZ-4 (GenBank序列号:JX524137) 设计并合成一对扩增ORF3全基因引物ORF3-P1/ORF3-P2。参考PEDV CV777 (GenBank序列号:AF353511) 、ZJCZ-4及疫苗株DR13 (GenBank序列号:EU054930) 的ORF3基因序列, 设计并合成了一对鉴定引物ORF3-JD1/ORF3-JD2, 鉴定引物位于ORF3缺失区 (245—294 nt) 两端的保守区, 其扩增范围覆盖整个缺失区域。以上两对引物如表1所示, 所有引物由上海英骏生物技术有限公司合成。 1.4 病毒rna的提取 离心处理中国农业科学院上海兽医研究所猪传染病研究室采集并保存的仔猪腹泻样品, 取PEDV分离株HLJ-1株和ZJCZ4株以及处理好的临床样品各300μL, 按RNeasy Plus Mini Kit说明书提取病毒RNA。同时根据RevertAidTM First Strand c DNA Synthesis Kit说明书将样品提取的RNA反转录成单链cDNA, 即提取的样品总的RNA 11μL, 随机引物Oligo (d T) 1μL, 5×Buffer 4μL, RNase Inhibitor