高脂血症食蟹猴模型的建立及初步分析.docx

? ? 高脂血症食蟹猴模型的建立及初步分析 ? ? 唐明甜，肖百全，徐世千，李比海，刘忠华，饶军华* (1.广东省生物资源应用研究所，广东省动物保护与资源利用重点实验室，广东省野生动物保护与利用公共实验室，广州 510260； 2.华南农业大学实验动物中心，广州 510642) 近年来，随着我国人口老龄化进程的加快以及饮食结构的改变，血脂异常总体患病率呈快速上升趋势，主要表现为高血脂。高血脂是冠心病、心肌梗死、心脏性猝死的重要危险因素[1]。目前，高脂血症及其并发症几乎占了全球死亡率的50%[2]，每年造成的经济损失高达1000亿美元。其发病率高、分布广，且呈年轻化趋势[3-4]。因此，高脂血症动物模型对于脂代谢性疾病以及由高血脂症继发的心脑血管疾病的研究具有重大意义[5]。目前，已报道的用于高脂血症动物模型研究的实验动物主要有兔、大鼠、小鼠等[5-7]，模型相对成熟。然而，近年来全球范围内生物制品类药物研发非常迅速，已经成为生物医药主要的增长点。生物制品类药物有其自身特点，其中种属特异性是该类药物研发时需要着重考量的因素，例如2017年美国FDA批准的首个生物制品类降脂药Praluent(PCSK9抑制剂[8])在临床前毒理学研究中大量使用灵长类动物，其主要原因为该类药物和灵长类动物之间存在交叉反应，而与啮齿类动物不存在交叉反应，即Praluent给药后可在灵长类动物体内发生药理学和/或毒理学效应，而不会与啮齿类动物的组织产生反应，丧失其药理学和毒理学的作用基础。目前，采用半流质膳食乳剂模拟人类高脂血症发病进程的灵长类动物模型尚未见报道[9-13]。 相比较于其他常用高脂血症实验动物，非人灵长类实验动物(NHP)具有以下优点：(1)NHP在基因、生理、生化指标和解剖学等方面都比其他动物更接近人类；(2)发病机制及伴随的风险因子也与人类疾病高度相似；(3)NHP有较长的生命周期；(4)能为药物的发现提供十分重要的临床前信息，特别是对于生物制品类药物，灵长类动物具有明显种属的优势；(5)从NHP实验获得的数据确保了将来临床应用的更高的效率和可靠性，使NHP成为临床前研究的“黄金标准”。 在此背景下，本研究选用食蟹猴为研究对象，模拟人类过度摄入高糖高脂饮食，采用灌胃法给予半流质高糖高脂膳食乳剂诱导建立高脂血症食蟹猴模型，旨在丰富现有高脂血症灵长类动物模型库，为生物制品类降脂药的研发提供合适、理想的动物模型。 1 材料与方法 1.1 实验动物 普通级雄性食蟹猴22只，来源于广东蓝岛生物技术有限公司[SCXK(粤)2014-0010]，成年组10只(对照组5只，处理组5只)，体重4～6 kg，5～7岁；中老年组12只(对照组6只，处理组6只)，体重7～10 kg，10～12岁。动物均饲养于广东省生物资源应用研究所灵长类实验动物研究中心普通级动物实验室(12 h/12 h昼夜周期，湿度40%～70%，温度16℃～26℃)[SYXK(粤)2018-0187]。本研究所涉及的动物实验方案经广东省蓝岛生物技术有限公司实验动物使用与管理委员会(IACUC)批准(L，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。 1.2 主要试剂与仪器 胆固醇(广州威佳科技有限公司)；胆酸盐(广州威佳科技有限公司)；蔗糖(广州华侨食品专营店)；猪油(广州市肉联厂)；舒泰50(Zoletil 50)麻醉剂。SANLI一次性使用人体静脉血样采集容器；离心管(Eppendorf管)1500 μL/2000 μL；离心机(Eppendorf Centrifuge 5810R)；全自动生化析仪(Hitachi 7020、7180)。 1.3 实验方法 1.3.1 膳食给喂方法 对照组雄性食蟹猴每日正常饲养，处理组雄性食蟹猴每日与对照组雄性食蟹猴一致，给予常规猴维持饲料。同时，根据雄性食蟹猴体重每日通过鼻饲管灌喂一次半流质高糖高脂膳食乳剂(膳食乳剂均为每日现配)，每只每天的灌胃剂量为5 mL/kg，每周6 d，连续灌喂21个月，每日记录雄性食蟹猴临床症状(例如活动、精神、粪便状况等)。诱导过程中半流质高糖高脂膳食乳剂给予量每两个月随雄性食蟹猴体重增减进行调整。 半流质高糖高脂膳食乳剂质量比配方为：蔗糖∶猪油∶胆固醇∶胆酸盐=10∶10∶1∶0.5，将各组份按其含量混合均匀，加热至约50℃，搅拌均匀乳化即得膳食乳剂。 1.3.2 体重、BMI动态监测 每2个月监测一次雄性食蟹猴的体重并计算BMI，计算方法：BMI=体重(kg)/身高(m2)，非人灵长类动物的身高为坐高[14]。 1.3.3 血脂四项的测定 采血前禁食约12～14 h后，后肢静脉采血2 mL，离心10 min(4℃，3000 r/min)，分离血清，于-80℃冻存备用。TC、TG采用氧化