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不同脂质体转染试剂对提高pc12细胞转染效率的影响 由pc12细胞诱导的神经轴突压能用于研究神经退行性疾病和脊柱损伤，也是神经内涵试验的模型。 细胞转染技术是分子生物学及基因工程关键步骤之一, 也是体外研究神经细胞特定基因表达调控及遗传病基因治疗的重要技术之一, 但常用的阳离子脂质体转染试剂对PC12 细胞转染效率低。 本研究参照相关文献, 通过在阳离子脂质体转染过程中加入氯喹及亚精胺, 同时调整阳离子脂质体转染试剂与DNA用量的比例和转染时间, 实现提高PC12 细胞转染率, 且未影响细胞的正常功能, 为PC12 细胞进行神经细胞基因功能及开发遗传病治疗方案等生物学研究提供了一种安全、廉价的新方法。 1 其他聚合物催化剂 主要试剂:PC12 细胞 (American Culture Collection) , RPMI1640 培养基 (Sigma公司) , Lipofectamine2000 (Invitrogen公司) , Fu GENE HD (Roche公司) , Poly Jet (Signagen Laboratoies公司) , Lipofectamine LTX andPlus (Invitrogen公司) , p EGFP -N1 (BD Biosciences公司) , 氯喹 (Sigma公司) , 亚精胺 (Sigma公司) , Ⅰ型牛胶原蛋白 (BD Biosciences公司) , 神经生长因子 (NGF) (Peprotech公司) , 噻唑蓝 (MTT) (Sigma公司) 。Axiovert 100 M倒置荧光显微镜 (Carl Zeiss公司) , Meta Morph图像分析处理软件 (Molecular Devices公司) , EL808 酶标仪 (Bio-Tek Instrument公司) 。 1.2 阳离子脂质体/dna复合材料nmf和细胞培养、转染及细胞活性检测 1.2.1 PC12 细胞培养PC12 细胞培养参照相关文献, 细胞密度至70% 左右时进行传代, 传至2 ~3代的PC12 细胞备用。 1.2.2 PC12 细胞转染PC12 细胞培养参照文献的方法, 转染的基本步骤: 将4 μL Lipofectamine2000转染试剂加入75 μL不含血清的新鲜RPMI 1640 培养基中混匀, 同时将1 μg质粒p EGFP-N1 加入150 μL不含血清的新鲜RPMI 1640 培养基中孵育5 min后将两溶液混匀, 室温静置30 min, 另将含 (或不含) 36 mmol/L氯喹、32 μmol/L亚精胺的无血清RPMI1640 培养基75 μL加入上述阳离子脂质体/DNA复合物, 移去细胞培养液后加入以上阳离子脂质体/DNA复合物, 培养4 h后再弃去上述含阳离子脂质体/DNA复合物的细胞培养液, 换成新鲜含5%胎牛血清、10%小牛血清的RPMI 1640 培养基, 每室300μL。 再培养48 h, 然后在Axiovert 100 M倒置荧光显微镜, 物镜40×和目镜10×放大倍数下拍照及计数分析。 见图1 (封三) 。 1.2.3 四甲基偶氮唑盐 (MTT) 试验参照文献方法, 用MTT试验分别测定对照孔、在转染过程中加 (或不加) 氯喹与亚精胺孔的PC12 细胞活性。 1.2.4 PC12 细胞神经轴突生长试验按文献方法, PC12 细胞转染48 h后, 将细胞培养基换成含1%胎牛血清、含 (或不含) 100 ng/m L神经生长因子 (NGF) 的新鲜RPMI 1640 培养基, 培养5 d后, 在倒置荧光显微镜物镜40×和目镜10×放大倍数下拍照及计数分析见图2 (封三) 。 1.2.5 转染效率与神经轴突判定及统计PC12 细胞转染48 h后, 计数绿色荧光蛋白阳性的细胞占细胞总数的百分比即为转染效率。 参照文献方法, 用MetaMorph图像分析处理软件计数并测量PC12 细胞神经轴突的长度。 1.3 统计学处理方法 采用统计软件SPSS 15.0 对数据进行分析, 正态分布计量资料以均数±标准差 (ue0af±s) 表示, 两独立样本的计量资料采用t检验。以P 0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 pc12细胞转染 当质粒p EGFP-N1 的用量为1 μg时, Lipofectamine2000 用量相对较低时, PC12 细胞转染效率与Lipofectamine2000 用量呈正相关, 但随着Lipofectamine2000 用量超过4 μL, 其毒副作用逐渐明显, 导致PC12 细胞转染效率逐步降低, 且绿色荧光蛋白阳性细胞的死亡率明显增加, 本研究结果表明, 对PC12 细胞转染, DNA∶Lipofectamine2000 用