线粒体的分离及活性测定实验原理及步骤.pdfVIP

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2023-08-17 发布于上海
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线粒体的分离及活性测定实验原理及步骤.pdf

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实验十一线粒体的分离及活性测定线粒体是真核细胞的一个重要细胞器，好氧生物细胞需能的 25%以上是靠有氧呼吸供给，而线粒体是细胞内唯一有氧呼吸的场所，因此，人们就一细胞“动力站”之称。线粒体结构和功能上的研究至今一直是一个非常活跃的领域，本试验在于学会分离线粒体和测定线粒体活力，以高活力的线粒体制剂用于各种目的的研究。一、仪器与设备： 1.冰冻高速离心机，或万转/分离心机。 2.组织捣碎机或匀浆器。 3.冰浴，研钵、漏斗、纱布（尼龙布）、量筒、微量注射器、移液管、试管等。 4.瓦氏呼吸器（氧极普测试系统）。 5.显微镜、冰浴。 6.分光光度计。二、材料与试剂： 1.绝大多数的动植物材料通常都可以制备线粒体，但最好是生活力强，生长旺盛，幼嫩组织为好，如心肌、肝脏、骨骼肌、黄化幼苗、块根、块茎等。 2.TriS-HCl （0.05M，pH7.2）缓冲液。 3.磷酸缓冲液（0.2M，Ph7.2 ）。 4.提取洗涤液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇（0.35M）、牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml），EDTA （0.001M），TriS-HCl （0.01M，pH7.2）缓冲液。 5.悬浮液（同试剂 4，但不加 BSA ）。 6.反应液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇（0.35M）、蔗糖（0.25M）、KCl （10ml， pH7.2）、EDTA （0.2mM）、MgCl2 （5mM）、TriS-HCl （10mM，pH7.2）。 7.反应底物： α—酮戊二酸 0.4M，ADP 0.06M。三、线粒体的分离：线粒体在离体条件先很容易受各种因素（物理和化学的）