实验农杆菌转化烟草和拟南芥.pptx

实验农杆菌转化烟草和拟南芥第1页/共17页 实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥Arabidopsis thaliana第2页/共17页Nicotiana tabacum 选择标记基因与报告基因必备条件：◆编码一种不存在于正常植物细胞中的酶◆基因较小◆能在转化体中得到充分表达◆检测容易，并且能定量分析 选择标记基因与筛选标记基因：npt-II 新霉素磷酸转移酶基因（卡那，新霉素，G418），aat（链霉素，壮观霉素），spe（壮观霉素），strl（链霉素），cat（氯霉素），bar（草苷膦） 报告基因：report gene（筛选标记之一）在转化系统中通过瞬时及稳定表达检测来确定转化的DNA顺序（基因）是否能在转化细胞中得到表达，起到报告的作用。gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因），gfp（绿色荧光蛋白基因）转化目的基因可以省略附加的报告基因，但选择标记基因是不可缺少的。第3页/共17页 植物基因转化受体◆高效稳定的再生能力◆较高的遗传稳定性◆具有稳定的外植体来源◆对选择性抗生素敏感◆对农杆菌侵染有敏感性植物基因转化受体系统类型：◆愈伤组织再生系统◆直接分化再生系统◆原生质体再生系统◆胚状体再生系统◆生殖细胞受体系统第4页/共17页 植物遗传转化方法双子叶植物无宿主限制，技术限制原生质体培养第5页/共17页 转基因方法农杆菌侵染法基因枪法第6页/共17页 农杆菌侵染法农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系第7页/共17页对单子叶植物不敏感根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。 T-DNA整合植物基因组的分子机理第8页/共17页T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入任何一条染色体。插入位点特点：◆T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点◆T-DNA与植物DNA连接处富含A-T碱基对◆植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。但在T-DNA的整合过程中常有植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复等现象，T-DNA的整合一定程度上依赖于植物内源重组系统。总之，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。 真空浸透法转化拟南芥第9页/共17页 农杆菌侵染瞬时转化烟草第10页/共17页 注射法瞬时转化烟草第11页/共17页 乙酰丁香酮第12页/共17页Vir区基因的活化直接调控着T-DNA的转移，酚类化合物对Vir区基因的活化具有重要作用。乙酰丁香酮（Acetosyringone，分子式:HOC6H2(OCH3)2COCH3）AS：遗传转化中常用的诱导能力较强的一种酚类化合物，乙酰丁香酮之所以能够提高外植体的转化频率，是因为它可诱导农杆菌Vir基因活化，从而促进外源基因的整合。使用方法：◆在侵染前4-6h加入液体培养基，使农杆菌既处于对数生长期，又处于vir基因高度活化状态，从而提高侵染能力◆悬浮离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入◆加在农杆菌和外植体共培养的培养基中，一般农杆菌附着16h后才能进行转化◆在农杆菌液体培养基及共培养基中都加入AS Silwet L-77第13页/共17页拟南芥、油菜等转化必须试剂之一，原产地为美国GE公司， Silwet-L77高效有机硅表面活性剂，能够极大的降低水的表面张力(水的表面张力为72.4mN/m，0.1%的Silwet-L77系列有机硅溶液的表面张力约为21mN/m),这使Silwet-L77有机硅溶液可轻易湿润几乎所有种类的叶面,相对于传统助剂,显著提高了在靶标生物的覆盖面.同时，Silwet- L77有机硅助剂具有极强的耐水冲刷及渗透能力。Silwet-L77是拟南芥及其它作物常用的转基因用表面活性剂。 植物瞬时表达系统第14页/共17页当外源基因导入植物细胞中以后，其表达方式有瞬时表达（transientexpression）和稳定表达（stable expression）两种。在瞬时表达状态的基因转移中，引入细胞的外源DNA和宿主细胞染色体 DNA并不发生整合。这些DNA一般随载体进入细胞后12小时内就可以表达，并持续约80小时左右。在稳定表达状态的基因转移中，导入宿主细胞的DNA整合到细胞染色体DNA上，以永久形式存在，并可传给后代，形成稳定的转化细胞。植物瞬时表达系统在启动子分析、基因功能分析和生产重组蛋白方面用途广泛。 Gus基因第15页/共17页gus基因来源于E.coli染色体上的uid A位点。编码β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被