SN_T 3741.1-2013国境口岸鼠类携带病原体检测方法 第1部分：致病性钩端螺旋体PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3741.1—2013国境口岸鼠类携带病原体检测方法第 1部分：致病性钩端螺旋体PCR检测方法Detection for pathogens of rodents at frontier ports-Part 1 : Detection for pathogenic leptospira2013-11-06 发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局64药 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准国境口岸鼠类携带病原体检测方法第1部分：致病性钩端螺旋体PCR检测方法SN/T 3741.1-—2013*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×12301/16印张 0.5字数 10 千字2014年5月第一版2014年5月第一次印刷印数1—1600*书号：155066·2-26952 SN/T 3741.1--2013前言SN/T3741《国境口岸鼠类携带病原体检测方法》共分为2部分：第1部分：致病性钩端螺旋体PCR检测方法；第2部分：土拉弗朗西斯菌PCR检测方法。本部分为SN/T3741的第1部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本部分主要起草人：孙肖红、张述铿、宋锋林、刘丽娟、刘键、高博、杨宇、胡孔新、王静。 SN/T 3741.1—2013国境口岸鼠类携带病原体检测方法第1部分：致病性钩端螺旋体PCR检测方法1范围SN/T3741的本部分规定了国境口岸鼠类样本采集、处理方法、致病性钩端螺旋体PCR检测的方法和结果判定。本部分适用于国境口岸鼠类携带病原体检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1鼠类rodent与鼠传疾病有关的鼠形动物（包括啮齿目、兔形目和食虫目动物）。3.2钩端螺旋体leptospira简称钩体，是一大类菌体纤细、螺旋致密，一端或两端弯曲呈钩状的螺旋体，其中一小部分为致病性钩端螺旋体，可引起人和动物钩端螺旋体病（简称钩体病）。钩体病是世界范围流行的一种人兽共患病，主要传染源是鼠类和猪。我国有28个省、市、自治区发现本病。人类感染除极个别来自实验室感染外，均因接触受染动物排出到环境中的致病性钩端螺旋体所致。4　要求鼠类携带病原体检测应在生物安全2级以上实验室（BSL-2)内进行。实验室应遵循GB 19489对生物安全2级及以上实验室的生物安全要求。5:实验仪器设备本方法使用的主要仪器如下：高速台式冷冻离心机；一组织研磨仪；生物安全柜；电泳仪；1 SN/T 3741.1—2013凝胶成像系统；-PCR 仪;微量加样器(10 μL、20 μL、100 μL、200 μI、1 000 μL);冰箱(2℃～8℃和20℃～-80℃）。6　主要试剂6.1核酸提取试剂:组织 DNA 提取试剂使用天根公司TIANamp Genomic DNA kit!）6.2PCR试剂:dNTP、10XPCR缓冲液、Tup酶使用TAKARA公司产品6.3引物：上游引物 PI序列（532)GACCCGAAGCCTGTCGAG，下游引物 P2序列（5′-3）：GCCATGCTTAGTCCCGATTAC↓扩增产物长度为500 bp6.4氧化锆颗粒（直径3mm）。6.5RPM1640培养液。７ PCR 检测7.1样本 DNA 的提取按照附录A进行。7.2反应体系的配制在200μL的PCR反应管中依次加人下列试剂:灭菌双蒸水14.35μL、10×PCR缓冲液2μL、dNTP(2.5 mmol/L)0.5 μL、10 μmol/L 上游引物 0.5μl、10 μmol:i下游引物 0.5 μl、(5 U/μl)Tup酶0.15 μl,模板 DNA 2μL，总体积为 20 μL。设立阴性对照、阳性对照和空白对照。将配制完成的反应体系瞬时离心，放入PCR仪。7.3反应条件PCR反应条件为 95℃ 5mih预变性,94元30 s.57℃45s.72℃:60 s,40个循环,72℃10 min。7.4结果判定取5μL.PCR产物进行2%琼脂糖电泳，依下列标准判断在阴性对照、空白对照未出现条带，阳性对照出现500bp扩增条带情况下，如待测样品未出现相应大小的