SNT 1955-2007动物源性食品中二苯乙烯类激素残留量检测方法 酶联免疫法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1955--2007动物源性食品中二苯乙烯类激素残留量检测方法酶联免疫法Determination of stilbenes residues in foodstuffs of animal origin- Enzyme linked immunosorbent assay2007-08-06 发布2008-03-01实施中华人民共和国发布去核染5惑童询真价国家质量监督检验检疫总局数码防伪， SN/T 1955-2007前言本标准的附录 A 和附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孙俐、郑文杰、唐丹舟、魏亚东、张宏伟。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 1955—2007动物源性食品中二苯乙烯类激素残留量检测方法「酶联免疫法1范围本标准规定了动物源性食品中二苯乙烯类激素残留量检验的酶联免疫测定方法。本标准适用于鸡肉、鱼肉、虾肉及鸡肝中已烷雌酚、已烯雌酚残留量的检测。2试样的制备和保存2.1试样的制备从所取全部样品中取出有代表性样品约1kg，充分搅碎，混匀，来用四分法，将样品分成两等份，装入洁净容器，加封并做标识。2.2试样的保存试样放置－20℃～一18℃条件下保存3测定方法3.1方法提要本方法的测定基础是竞争性酶联免疫反应。酶标板上已包被的雌酚抗体，可与已烷雌酚，已烯雌酚发生交联反应，标准液或样品中的雌酚与辣根过氧化标记的雌酚抗原共同争夺雌酚抗体上的结合位点，用酶标仪测量微孔溶液的吸光度值，雌酚浓度与吸光度值成反比，按绘制的校正曲线定量计算。3.2试剂和材料除另有规定外，所用化学试剂沟为分析纯,或为更高级别。永为重蒸馏水。3.2.1二苯乙烯类免疫测定试剂盒(参见附录(A)3.2.2叔丁基甲基醚：色谱纯。3.2.3三氯甲烷。溶在水中，并定容3.2.46mol/L磷酸:吸取58.B.mL磷100 m1袭3.2.5乙醇。3.2.6β-葡糖苷酸酶(Sigma G-076)。3.2.7乙酸钠(CH;COONa·3H,Q):3.2.8乙酸钠缓冲液(0.1mol/L,pH=5:0)：称取13.6g乙酸钠溶解于800mL水中，用氢氧化钠溶液调节pH值至5.0±0.1,加水定容至1000mL。3.2.9氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取 40 g氢氧化钠溶于1 000 mL水中。3.2.10甲醇。标准品：已烷雌酚标准品，已烯雌酚标准品纯度均≥98%。3.2.11雌酚标准品溶液的配制：准确称取适量的已烷雌酚和已烯雌酚标准品，用甲醇配制成3.2. 12img/mL标准贮备溶液，于4℃～8℃条件下保存。3.3仪器和设备3.3.1酶标仪：波长450nm。3.3.237℃±2℃培养箱。3.3.3均质器。 SN/T 1955—20073.3.4天平。3.3.5 离心机:3 000 r/min。3.3.6氮气吹干仪。3.3.7振荡器。3.3.8洗板机。3.3.9[固相萃取仪。3.3.10微量加样器:20 μL,50 μL,100 μL,200 μL。3.3.11微量多通道加样器：200μL。3.3.12免疫亲和柱:50 ng,5 mL。3.4　试样提取和净化3.4.1提取肌肉样品称取2.5g(精确到0.1g)试样于离心管中,加入15 mL叔丁基甲基醚,均质 30 s,涡旋振荡 3min。在2000 r/min下离心10 min,移取12mL醚层液体,在 40℃氮气流下蒸发至干燥。用 1mL三氯甲烷溶解干燥物，涡旋振荡 3 min。加 2 mL 1 mol/L 氢氧化钠,涡旋振荡 3 min。在 2 000 r/min 下离心10 min,移取上层液到另一试管中,保留 1 mL·水相。再加人 1 mL 1 mol/L氢氧化钠到三氯甲烷溶液中,涡旋振荡3min,在 2 000 r/min 下离心10 min,移取上层提取液到另一试管中,保留 1 mL水相。合并两次提取液,加人 200 μL的6 mol/L磷酸中和2 mL的氢氧化钠提取液后待净化。肝脏样品称取 2.5g(精确到0.1g)试样至离心管中，加人 3mL乙酸钠缓冲液（0.1mol/L;pH 5.0），加人8000单位β葡糖苷酸酶,均质约 30 。37℃士2℃培养2h,以下按 提取步骤操作。3.4.2净化以免疫亲和柱净化样品提取液。用柱储存缓冲液过柱，再用15mL柱洗涤缓冲液平衡柱子（流速≤3mL/min）。取全部中和后的样品提取液过柱（重力引流）。用5 mL柱洗涤缓冲液洗涤柱子两次（流速2mL/min）。用5mL水洗涤柱子（流速≤2mL/min）。用3mL乙醇/水（70/30，体积比）洗脱样品中可能存在的雌激素。此步的洗脱液用干净的试管收