NY_T 2837-2015蜜蜂瓦螨鉴定方法.pdf

ICS 65.140B 47NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2837—2015蜜蜂瓦螨鉴定方法Identification of Varroa from honey bees2015-12-01实施2015-10-09发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 2837---2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，本标准参考了世界动物卫生组织（OIE)制定的《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2012版）。本标准由农业部兽医局归口。本标准起草单位：中国农业科学院蜜蜂研究所。本标准主要起草人：周婷、王强、代平礼、吴艳艳、周玮、徐书法、王星、段俊明、黄智勇。1 NY/T 2837---2015蜜蜂瓦螨鉴定方法1范围本标准规定了蜜蜂主要体外寄生瓦螨鉴定方法。本标准适用于蜜蜂瓦螨——狄斯瓦螨（Varroadestructor）、雅氏瓦螨（V.jacobsoni）、林氏瓦螨（V.rindereri）和恩氏瓦螨（V.underwoodi）的鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。NY/T1954蜜蜂螨病病原检查技术规范SN/T1684瓦螨病诊断方法3试剂、材料和仪器见附录A。4瓦螨的分离方法4.1碎屑分离法4.1.1随机分离法将包有铁纱网的薄铁板置于蜂箱底部，通常1d～2d内产生的碎屑中可见少量的瓦螨。4.1.2药物分离法按照NY/T1954的规定执行。4.2封盖子分离法用刀割去封盖子脾的房盖，再将温水喷淋巢脾，下面放置双层网筛，抖出巢房内的大幼虫或蜂，使蜜蜂大幼虫和蜂蛹留在上层粗网筛上（孔径2.2mm），而瓦螨落在下层细网筛中（孔径1mm）。4.3成年蜜蜂糖粉或面粉分离法将蜜蜂抖落于大漏斗内，利用500mL或1000mL容量的广口瓶收集大漏斗内的蜜蜂，约占瓶容量的1/3。取10g80目的细糖粉或面粉倒人装有蜜蜂的广口瓶中，瓶口用3mm孔径铁纱网封严；将广口瓶横置放于平面上来回滚动3min，使糖粉或面粉均匀黏附至每只蜜蜂体上。将广口瓶瓶口朝下剧烈振荡，使糖粉或面粉及瓦螨振落于光滑白纸上，再分离收集掉落的瓦螨。5瓦螨的鉴定方法5.1形态学鉴定利用体视解剖镜观察并记录瓦螨的大小、形状、背板颜色、胸板、生殖腹板、肛板、腹侧板和后足板形状，刚毛对数和足等的形态特征。5.2分子生物学鉴定5.2.1样本采集按照第4章的分离方法取得瓦螨，并将瓦螨浸于70%乙醇溶液中。一20℃保存。1 NY/T283720155.2.2总DNA简易提取法单个瓦螨用无菌水洗涤，吸水纸吸干表面；将瓦螨置于1.5mL离心管内，加入40μL2×WLB缓冲液(其中，蛋白酶K终浓度50μg/mL)后进行研磨，50℃孵育1h;100℃煮沸10min～15min，冷却至室温，加入40uL超纯水，1000g离心5s备用5.2.3 PCR 扩增瓦螨mtDNA CO-I 基因片段引物序列上游引物：5-GGAGGAGATCCAATTCTATATCAAC-3;下游引物:5-CCTGTTATAATAGCAAATAC-3;预期扩增产物为458bp。PCR扩增体系50 μL:PCR扩增体系总体积为10 μL总DNA提取液各1μL上、下游引物Taq酶0.5 μL5 μL10Xbuffer1 μL10XdNTP(各2.5mmol/L)超纯水31.5 μLPCR 程序94℃5 min94℃60 s50℃75 sX30个循环72℃90 s72℃5 min4℃PCR扩增产物凝胶电泳检测1.2%琼脂糖凝胶配制方法见附录A.1.3；5μL扩增产物加1μL上样缓冲液（6×DNALoadingBuffer）,DNAMarkerI(0.05mgDNA/mL)用量4μL。120V,30min；凝胶成像仪观察，并记录分析；阳性PCR产物送测序公司进行序列测定。5.2.4瓦螨mtDNA CO-I 基因限制性内切酶反应体系SacI限制性内切酶消化体系2 μLBuffer LSac I1 μL7 μLPCR产物超纯水8μL37℃水浴2h，1.2%琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，电泳及凝胶成像方法参见。XhoI限制性内切酶消化体系2 μLBuffer H1 μLXho I7 μLPCR产物超纯水8 μL37℃水浴2h，1.2%琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，电泳及凝胶成像方法参见。2 NY/T2837-20156结果判定6.1形态学鉴定狄斯瓦螨形态学鉴定按照SN/T1684和NY/T1954（见图1）；雅氏瓦螨（体长平均1063.0μm，宽1506.8um）与狄斯瓦螨（体长平均1167.3um，宽1708.9um)形态相似，但前者比后者的体型偏小，而且更接近圆形（见图1和图2）；