NY_T 2475-2013辣椒品种鉴定技术规程 SSR分子标记法.pdf

ICS 67.080.20B 31NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2475—2013辣椒品种鉴定技术规程SSR分子标记法Identification of pepper varieties--SSR marker method2014-04-01实施2013-12-13 发布中华人民共和国农业部3发布 NY/T 2475-—2013目次前言范围1规范性引用文件2术语和定义3原理4仪器设备及试剂56溶液配制7引物..8参照品种及其使用·9操作程序310等位变异数据采集..11判定标准仪器设备及试剂附录A（规范性附录）溶液配制·附录B(规范性附录)核心引物·0附录 C(规范性附录)12参照品种名单·附录 D(资料性附录).-T NY/T 2475—2013前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，本标准由农业部种子管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会SAC/TC277)归口。本标准起草单位：中国农业科学院蔬菜花卉研究所、云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所、农业部科技发展中心。本标准主要起草人：张建华、张宝玺、管俊娇、毛胜利、王立浩、杨晓洪、张惠、张正海、王江民、刘艳芳。- NY/T 2475--2013辣椒品种鉴定技术规程SSR分子标记法1范围本标准规定了利用简单重复序列（Simple sequence repcats，SSR）分子标记进行辣椒（CapsicumL.）品种鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准。本标准适用于辣椒SSR标记分子数据的采集和品种鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1核心引物coreprimer多态性好、PCR扩增稳定的套SSR引物。3. 2参照品种reference variety对应于SSR位点t:不同等位基因的--组品种。参照品种用于辅助确定待测样品等位基因的大小，校正仪器设备的系统误差，4原理SSR广泛分布于辣椒基因组中，不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。由于每个SSR位点两侧的序列-般是高度保守和单拷贝的，因而可根据其两侧的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对两条引物间的DNA序列进行扩增。在电泳过程中，主要由于SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度的PCR扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定辣椒品种。5仪器设备及试剂仪器设备及试剂见附录A。6溶液配制溶液配制方法见附录B。7 引物引物相关信息见附录C。8参照品种及其使用参照品种的名称见附录C，参照品种来源参见附录D。1 NY/T 2475—-2013在进行等位变鼻检测时，应同时包括相应参照品种。注1：多个品种在某·SSR位点上可能都具有相间的等位变异。在确认这些品种该位点等位变异大小与参照品种相同后，这些品种也可以代替附录C中的参照品种使用。注2：同·名称不同来源的参照品种的某：·位点上的等位变异可能不相同，在使用其他来源的参照品种时，应与原参照品种核对，确认无误后使用。注3：对于附录（中未包括的等位变异，应按本标准的方法，确定其大小和对应参照品种。9操作程序9.1重复设置设定2次生物学重复。9.2样品准备种子样品的分样和保存，应符合GB/T3543.2的规定。每个品种分别取2个样品，每个样品30个个体（叶片），等量混合。9.3DNA提取采用CTAB法：取幼嫩组织卷好0.2g放人1.5mL离心管中，在液氮中研碎；或将种子研碎，放人1.5ml.离心管中。加400μL预热（65℃）的I)NA提取液，摇匀；将离心管置人65℃恒温水浴45min~60min，在此期间，每隔10min颠倒混匀1次；取出离心管，冷却至室温；加人等体积的氯仿异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀，10000g离心10min；转移上清液200ul至另支1.5ml.离心管中，加人400μL一20℃预冷无水乙醇沉淀DNA。10000g离心1min，弃.上清液，加500μL75%乙醇，洗涤沉淀2次，每次10min;室溢风f，加100μLTE(pH8.0)溶液溶解DNA。用紫外分光光度计检测DNA浓度，将DNA稀释到200ng/μl，一20℃保存。注：以上为推荐的--种IDNA提取方法。所获IDNA质量能够符合PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本标推。9.4PCR扩增9.4.1反应体系20ul的反应体积，含每种dNTP0.25m