SN_T 4462-2016国境口岸O1群和O139群霍乱弧菌和霍乱肠毒素三重实时PCR的检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4462—2016国境口岸01群和0139群霍乱弧菌和霍乱肠毒素三重实时PCR的检测方法Detection method for 01 serotype,0139 serotype vibrio cholera and enterotoxinby triplex real-time fluorescence PCR at frontier port2016-03-09发布2016-10-01实施中华人民共和国发布同国家质量监督检验检疫总局全售 SN/T4462—2016前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：周冬根、王燕、李红、孙大为、郑剑宁、裘炯良、倪敏君、张升、张、杨天赐、莫秋华。- SN/T4462—2016国境口岸01群和0139群霍乱弧菌和霍乱肠毒素三重实时PCR的检测方法1范围本标准规定了国境口岸O1群和O139群霍乱弧菌以及霍乱肠毒素基因三重实时PCR检测方法检验的对象、标本采集、检验程序及结果判定报告本标准适用于国境口岸对O1群和O139群霍乱弧菌以及霍乱肠毒素基因的实验室检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR)技术的应用3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.101群霍乱弧菌01serotypevibrio cholera，又可分为3菌体抗原由3种抗原因子A、BC组血清型：小川型、稻叶型和彦岛型。根据表型差异，01群霍乱弧菌的每一个血清型还可分为2个生物型，即古典生物型和ElTor生物型。3.20139群霍乱弧菌0139 serotyperioholera其临床表现及传播方式上与01群霍乱弧菌完全相同，但不能被1群霍乱弧菌诊断血清所凝集，抗01群的抗血清对0139菌株无保护性免疫。在水中的存活时间较01群霍乱弧菌长。3.3霍乱肠毒素vibrio cholera enterotoxin是目前已知的致泻毒素中最为强烈的毒素，是肠毒素的典型代表。作用于肠细胞膜表面上的受体，导致肠黏膜细胞分泌功能大为亢进，使大量体液和电解质进人肠腔而发生剧烈吐泻。4检测对象4.1疑似病人的排泄物、呕吐物。4.2被霍乱弧菌污染或有霍乱弧菌污染嫌疑的交通工具、行李、货物、集装箱、邮包、饮用水、压舱水、污水、餐饮用具、生活用品。5主要仪器设备本方法使用的主要仪器如下：1 SN/T4462—2016超净工作台；二级生物安全柜；微型混合器、涡旋振荡器；冰箱：4℃；-20℃；恒温金属浴；普通台式离心机；高速冷冻离心机（离心力可达20000g）；可调式微量加样器（10μL、100μL、1000μL)及配套带滤芯吸头；荧光PCR检测仪。6主要试剂本方法使用的主要试剂如下：QiagenmultiplexPCRkit检测试剂盒无DNA酶的DEPC水；引物和探针：引物和探针序列见表1。表1荧光PCR检测的引物和探针扩增片段引物/序列（5°-3）大小/bp探针名称O1-FCCAGATTGTAAAGCAGGATGGA163O1-RGGTCATCTGTAAGTACAACO1-PFAM-CCCGGAGTTTGTAAGCCCACTACCGGG-DABCYLO139-FCATACCAACGCCCTTATCCATTO139-R120GCATGACTGGCATCCCAAAATO139-PHEX-CGGGTGAGAAAAGACAGCAATAACACCCG-DABCYLctxA-FTCCGGAGCATAGAGCTTGGA80ctxA-RTCGATGATCTTGGAGCATTCCctxA-PCY5-CCGTGGATTCATCATGCACCGCCACGG-DABCYL7检验程序7.1样本采集7.1.1粪便样本采集采集自然排出的新鲜大便于灭菌容器中，水样便采集1mL～3mL，成形便采集1g～3g；亦可用已湿润的直肠棉由肛门插入直肠内3cm～5cm处并轻轻旋转，确保退出的棉拭上有可见的粪便，把棉拭放人灭菌容器中。粪便样本宜在发病早期（发病4d内），服用抗菌药物之前采集。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的1)效果，则可使用这些等效产品。2 SN/T4462—20167.1.22呕吐物样本采集采集自然呕吐的呕吐物于灭菌容器中，水样呕吐物采集1mL～3mL，非水样呕吐物采集1g~3g。7.1.3水样