SN_T 4875-2017来檬丛枝植原体检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4875--2017来檬丛枝植原体检疫鉴定方法Detection and identification of Lime witchesbroom phytoplasma2018-03-01实施2017-07-21发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真伪 SN/T 4875—2017前言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国四川出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王有福、李鑫、张婧、曹冬梅、胡强、刘卉秋、王秀芬、徐凤敏。 SN/T4875—2017来檬丛枝植原体检疫鉴定方法1范围本标准规定了来檬丛枝植原体的检疫和鉴定方法本标准适用于进境来檬苗木中来檬丛枝植原体的检疫和鉴定2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1157进出境植物苗木检疫规程3来檬丛枝植原体基本信息英文名：Lime witchesbroom phytoplasma分类地位：软壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes），非固醇菌原体目（Acholeplasmatales），非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（Phytoplasma），16SrⅡ植原体组。来檬丛枝植原体的其他信息参见附录A。4方法原理来檬丛枝植原体生物学特性和基因特性作为本标准鉴定方法的主要依据。以组织材料症状观察、DAPI染色的形态学为初步筛查方法；以植原体核糖体16SrDNA序列特征为主要的判定依据。5仪器设备和主要试剂5.1仪器设备定性PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、台式冷冻离心机、纯水仪、台式小型离心机、冰箱、旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、水浴锅、凝胶成像系统等。5.2用具移液器、研钵、离心管、PCR管、量筒、烧杯、酒精灯、镊子等。5.3主要试剂除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水。PCR反应体系用双蒸水。其他试剂比如各种溶液、缓冲液和培养基都是检测方法特有的，都应按附录B要求准备。商品化试剂参见其使用说明。植物DNA提取试剂盒、PCRPremix、超纯水、DNAmarker及DNA提取试剂等。1 SN/T4875—2017核酸提取研磨液（100mL)：K,HPO4·3H,O,2.17g;KHzPO4,0.41g；蔗糖，10g;BSA（FractionV),0.15g;PVP-102g。pH7.6高温灭菌，4℃保存。DNA提取液：Tris-HCl,100mmol/L;EDTA,100mmol/L;NaCl,250mmol/L；调pH至8.0。50XTAE.2.0mol/LTris,1.0mol/LNaAc,50mmol/LEDTA,pH8.0DAPI:4,6-二胀基-2-苯基吲哚。6检测鉴定方法6.1症状观察6.1.1现场查验现场对来檬苗木进行观察，症状描述参见附录A，选取可疑症状植株样品和随机样品（具体取样方法见SN/T1157)带回实验室检测。6.1.2DAPI染色选取幼嫩组织（新叶叶梗、枝梢、茎秆及根部韧皮部组织），切片，用1μg/mLDAPI溶液染色，在460nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均，故每个样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。6.2DNA提取取所选新鲜材料的韧皮部及叶中脉0.3g，或干材料0.1g，取适量液氮研磨，再加人研磨液2mL充分研磨，4℃12000r/min离心20min，弃上清液。加人500μLDNA提取液，20μL蛋白酶K（5mg/mL），轻轻混匀，加人80μL10%十二烷肌氨酸钠，混匀，在55℃温育1h～2h，4℃6000r/min，10min，取上清液。加人2/3体积异丙醇到上清液中，轻混匀，一20℃保持至少30min，4℃12000r/min，15min，弃上清液。加人600μLTE缓冲液，30μLSDS，12μL蛋白酶K（5mg/mL），混匀，37℃温育30min～60min。加100μL5mol/LNaCl混匀，再加人84μLCTAB/NaCl溶液混匀，65℃温育10min。加人等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1）混匀，4℃12000r/min，5min，重复直至无中间白色层。上清液加人2/3体积异丙醇，混匀，20℃保持至少3min，4℃12000r/min，10min，弃上清液。加人1mL70%乙醇洗涤，12000r/min，1min。洗涤2次。加人30μLTE混匀溶解。一20℃冰冻保存。