SN_T 2584-2010水稻及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2584—2010水稻及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法Protocol of real time polymerase chain reaction for detecting genetically modifiedcomponents in rice and its derived products2010-05-27发布2010-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2584—2010前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈红运、梁新苗、陈双雅、王振华、李玲、黄文胜、胡小钟、朱水芳、陈洪俊。 SN/T2584—2010水稻及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了水稻及米制品中转基因成分的检测方法。本标准适用于转Bt基因抗虫水稻（TT51-1，克稻，Ⅱ优科丰6号）和耐除草剂转基因水稻（LLRICE62，LLRICE601)的检测，也适用于米制品中转基因成分的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB6682分析实验室用水规格和实验方法SN/T1193基因检验实验室技术要求SN/T1194植物及其产品中转基因成分检测抽样和制样方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。3. 1crylAc基因crylAcgene编码苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis）CrylAc杀虫晶体蛋白的基因。3. 2crylAb基因crylAb gene编码苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis）CrylAb杀虫晶体蛋白的基因。3.3crylAb/crylAc融合基因crylAb/crylAefusiongenecrylAb基因与 crylAc基因经人工拼接形成的基因。3. 4sucrosephosphate synthasesps基因蔗糖磷酸合酶基因，在本标准中用作水稻内标准基因。3.5gos9基因gosgene一个根部表达的水稻基因，在本标准中用作水稻内标准基因。3. 6PLD基因phospholipaseDgene磷脂酶D基因。3.7Ct值cycle threshold每个反应管内的荧光信号到达设定的阅值时所经历的循环数，某些品牌的定量PCR仪也称为Cp(cross point)值。1 SN/T2584—20104原理应用TaqMan探针技术，根据常用的筛选基因（启动子，终止子等）序列、构建特异性序列（启动子或终止子与目标基因之间的序列）、转化体特异性序列和水稻内源基因序列，设计引物和荧光探针，对试样中基因组DNA进行PCR扩增。在PCR反应过程中，荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，因此可根据荧光信号的强度判定样品中是否含有特定的基因。5仪器和试剂5.1主要仪器定量PCR仪；冷冻研磨仪；消毒灭菌锅；制冰机；核酸蛋白分析仪；高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机；低温冰箱：旋涡振荡器；微量移液器。5.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB6682中一级水的规格。主要试剂见附录A。水稻内源基因和检测用外源基因的引物和探针序列见表1。表1引物和探针序列终浓度/检测基因引物/探针序列（5-3)用途(nmol/L)上游引物：ttgcgcctgaacggatat400sps下游引物：cggttgatctttcgggatg400探针：tccgagccgtccgtgcgtc200上游引物：ttagcctcccgctgcaga300水稻内源基因。gos9下游引物：agagtccacaagtgctcccg300任选其一探针：cggcagtgtggttggttcttcgg100上游引物：tggtgagcgtttgcagtct200PLD下游引物：ctgatccactagcaggaggtcc200探针：tgttgtgctgccaatgtggcctg200上游引物：cgacagtggtcccaaaga200CaMV35S下游引物：aagacgtggttggaacgtcttc200探针：tggacccccacccacgaggagcatc100进出口水稻及米制品中转基因成上游引物：atcgttcaaacatttggca200分筛选检测NOS下游引物：attgcgggactctaatcata200探针：catcg