SN_T 3984-2014犬细小病毒实时荧光PCR检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3984-2014犬细小病毒实时荧光PCR检疫技术规范Quarantine protocol for canine parvovirus by real-time PCR2014-11-19 发布2015-05-01 实施中华人民共和国发布0690:13国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真伪 SN/T 3984--2014前言本标准按照GB/T 1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国四川出人境检验检疫局、西南民族大学本标准主要起草人：陈世界、杨苗、林华、胡娟、杨晓农、张焕容、杨发龙、薛昌华、于学辉、牟静、王斌、黄河、余华。I SN/T 3984--2014犬细小病毒实时荧光PCR检疫技术规范1范围本标准规定了犬细小病毒实时荧光PCR检测方法的技术要求本标准适用于易感动物犬细小病毒的检测。规范性引用文件2下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范SN/T 21233仪器和试剂3.1主要仪器3.1.1荧光定量 PCR仪。3.1.2，高速冷冻离心机。3.1.3，旋涡混匀器。3.1.4恒温循环水浴槽。低温冰箱。.6可调单头微量移液器。3.2主要试剂试剂为分析纯或生化试剂，用于实时荧光PCR的试剂均用无DNA酶污染的容器分装。所有试验用水均为灭菌超纯水，应符合GB/T 6682中的三级水要求。3.2.1动物粪便DNA提取试剂盒。3.2.2动物血液与组织DNA提取试剂盒。3.2.3荧光定量PCR反应预混液。3.2.4犬细小病毒阳性质粒,DNA序列为 GGCCTGGGAACAGTCTTGACCAAGGAGAACCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTGCAAAAGAACACGACGAAGCTTACGCTGCTTATCTTCGC。3.2.5实时荧光PCR扩增所用的引物和探针的序列见表1。表 1引物和 TaqMan 探针长度/bpTm值/℃GC/ %序列引物和探针60.02055.95′-GGCCTGGGAACAGTCTTGAC-3上游引物52.42154.45′-GCGAAGATAAGCAGCGTAAGC-3下游引物60.02562.65-FAM-CCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTG-TAMRA-3 Taqman 探针1 SN/T 3984--20144样品的采集和保存4.1粪便样品的采集和保存从直肠内采集的样品以新鲜粪便为宜。少量采集时，先在每个灭菌离心管中加人1mL样品保存液（pH一7.4的磷酸缓冲液），用灭菌的棉拭子插人肛门，转动至少3圈，从直肠深处蘸取粪便。之后立即将子浸人样品保存液中，剪去露出部分，盖紧离心管，贴上标签，密封低温保存。采集较多量的粪便时，可将动物肛门周围消毒后，用带上胶手套的手伸人直肠内取粪便，也可用压舌板插入直肠，轻轻用力下压，刺激排粪，收集粪便。所收集的粪便装人灭菌的容器内，密封并贴上标签。样品采集后于4℃冷藏保存，然后立即运送实验室（夏季不超过24 h，冬季不超过2d）。短时间不能送达的样品应于20℃冷冻保存。样品运送时应保持冷冻状态，并防止倾倒。送达实验室后，若暂时不进行处理，则应冷冻（以70℃或以下为宜)保存,不应反复冻融。4.2病变肠组织样品的采集和保存样品应采集增生、出血的病变小肠肠管约6cm长。已死亡的动物应尽快无菌采集（夏天不应超过2h，冬天不超过6 h）。样品组织应置于样品袋中，贴上标签，4℃冷藏保存和运输。如病料不能立即进行检验，或须寄送到外地检验时，应加人适量的样品保存剂（饱和盐水或30%甘油缓冲液），容器加塞封固。4.3其他样品的采集和保存参考采集附录A描述的典型病变样品，采样、运输及保存技术参照SN/T2123。5实时荧光PCR检测方法5.1DNA 提取按照商品化试剂盒说明书要求提取相应样品的DNA。5.2对照样品5.2.1阳性对照犬细小病毒阳性质粒DNA模板。5.2.2阴性对照用已知犬细小病毒阴性组织制备的DNA模板5.2.3空白对照用等体积的水代替DNA模板。5.3扩增反应体系实时荧光PCR扩增反应体系见表2。2 SN/T 3984--2014表 2实时荧光PCR反应体系终浓度每管加人量/μl试剂名称12.51X2×荧光定量 PCR反应预混液1.20.48 μmol/L10μmol/I.上游引物0.80.32 μmol/1.10 μmol/L下游引物2 0.8 μmol/1.10 μmol/L Taqman 探针1待测样品DNA模板7.5灭菌超纯水25反