NYT 1188-2006水泡性口炎诊断技术.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1188--2006水泡性口炎诊断技术Diagnosis techniques for vesicular stomatitis2006-0710 发布2006-10-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 1188—2006前言水泡性口炎(VS)是由弹状病毒科的水泡性口炎病毒(VSV)引起的马、牛和猪的一种水泡性疾病，被世界动物卫生组织(OIE)列为 A类动物疫病,我国将其列为二类疫病。本病临床上与口蹄疫、猪水泡病、猪水泡疹很难区别,主要表现为口唇部有水泡、溃疡、糜烂,影响采食，导致生长缓慢,影响经济效益。OIE采用组织细胞、鸡胚、实验动物等方法分离水泡性口炎病毒，进一步用间接夹心酶联免疫吸附试验(IS-ELISA)和补体结合试验(CF)对分离的病毒进行鉴定;在国际贸易中,OIE指定用液相阻断酶联免疫吸附试验(LP-ELISA)、病毒中和试验(VN)和补体结合试验(CF)检测水泡性口炎血清样品。本标准中水泡性口炎的病毒分离试验、IS-ELISA试验和病毒中和试验,是根据 OIE《哺乳动物、禽、蜜蜂 A和B类疾病诊断实验和疫苗标准手册》(2000 版)中的诊断技术以及国内近年来在水泡性口炎方面的研究成果而制定的,其中病毒分离试验、IS~ELISA试验和病毒中和试验均与OIE的标准性文件等效。本标准的附录 A为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部动物检疫所。本标准主要起草人：李其平、龚振华、陆明哲、郑增忍、郭福生、蒋正军、王海霞。1 NY/T 1188—2006水泡性口炎诊断技术1 范围本标准规定了水泡性口炎(VS)的病毒分离鉴定试验、间接夹心酶联免疫吸附试验(IS-ELISA)和病毒中和试验(VN)的技术要求。本标准适用于水泡性口炎流行病学调查、临床诊断和实验室检测等。2 病原分离与鉴定2.1 病原分离2.1.1器材100mL玻璃细胞培养瓶，恒温水浴箱，CO2培养箱，超净工作台，倒置显微镜。2.1.2试剂及溶液配制MEM营养液,PBS缓冲液,犊牛血清，7.5%碳酸氢钠溶液,青霉素(104TU/mL)与链霉素(104mg/mL)溶液,3%的谷氨酰胺溶液,Hanks液,灭菌生理盐水,0.25%胰蛋白酶溶液,缓冲甘油(pH 7.2~7.7),配制方法见附录A。2.1.3样品的采集采集发病动物口鼻部位的水泡皮和水泡液,水泡皮加人含50%甘油的PBS缓冲液中，水泡液置于含2%犊牛血清和5%葡萄糖的灭菌生理盐水中,冷藏送检。保存液的体积不能超过水泡皮或水泡液体积的2倍。不能获得水泡皮和水泡液时,牛可用探杯采集食道/咽(OP)黏液,猪可采集咽喉拭子,置于无血清的细胞培养液中,冷藏送检。无血清细胞培养液的体积不能超过黏液或咽喉拭子的2倍。2.1.4样品的处理将水泡皮剪碎,研磨,悬浮于 5倍体积的 pH7.2、0.2 mol/L的 PBS缓冲液中(含青霉素 1000IU/mL、链霉素 1000 mg/mL),4℃浸渍16 h~20 h,以3000 r/min离心15 min,取上清液,用0.2 μm 微孔滤膜过滤。将水泡液、OP液、棉拭子浸液加青霉素至1000IU/mL、链霉素至1000mg/mL,离心,取上清液,用0.2 μm 微孔滤膜过滤。2.1.5 细胞接种将2.1.4的样品1mL 接种长成单层的VERO细胞、BHK-21细胞或IB-RS-2细胞,37℃吸附 1 h,中间摇动一次。加人9mL维持液,37℃、5%COz培养箱中培养。每天观察细胞病变效应(CPE),连续观察 3天。 如果细胞出现圆缩、聚集、固缩、脱落等病变,则进一步按方法2.2 进行病原鉴定。盲传 3代无病变者按2.1.8处理。2.1.6 鸡胚接种将鸡胚卵置于蛋架上，气室朝上，以碘酒、酒精棉球消毒气室,用剪刀去除气室部蛋壳。用无菌眼科镊子撕去一小片内壳膜,在绒毛尿囊膜上滴人2.1.4中的样品0.2mL。用无菌脱脂棉撕成薄片盖往蛋壳,用蜡封口，于37℃孵育。1 NY/T 1188—200如果鸡胚2天内死亡,鸡胚周身呈明显充血、出血，尿囊膜肥厚,收获尿囊膜按2.2方法作进一步鉴定。盲传3代无病变者按2.1.8处理。2.1.7乳鼠接种将2.1.4的样品颈部皮下接种2日～7日龄乳鼠,每只接种0.2mL。每天观察乳鼠病变,连续观察 5天。 如果乳鼠出现死亡、生长不良等病变,则按 2.2方法进一步鉴定。盲传3代无病变者按2.1.8 处理。2.1.8可疑非免疫动物样品盲传3代未分离到病毒者,可进一步采集 7d～14 d后的该动物血清,用方法 3进行抗体检测。若检测结果为阴性,则判为无 VSV感染;若检测结果为阳性,则判为有VSV感染。2.2病原鉴