SN_T 3559-2013裂谷热病毒RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3559—2013裂谷热病毒RT-PCR和实时荧光RT-PCR 检测方法RT-PCR and real time RT-PCR detection methodsof Rift Valley fever virus2013-03-01发布2013-09-16 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3559—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：李小波、郑夔、师永霞、相大鹏、洪烨、黄吉城、幸芦琴、郭波旋、钟玉清、李燕。i SN/T 3559—2013裂谷热病毒RT-PCR和实时荧光RT-PCR 检测方法1范围本标准规定了国境口岸裂谷热检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，裂谷热病毒实时荧光RT-PCR检测方法及RT-PCR检测方法。本标准适用于国境口岸人出境人员及口岸蚊媒携带裂谷热病毒的分子生物学检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489　实验室生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录(卫生部)3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1裂谷热病毒Rift Valley fever virus;RVFV种属于布尼亚病毒科白病毒属、基因组为单股负链RNA的病毒,有包膜，直径约为 90 nm～100 nm。3.2裂谷热?Rift Valley fever;RVF由裂谷热病毒引起的、主要流行于非洲次撒哈拉地区的一种急性病毒性人畜共患病。人主要通过接触感染动物的组织、器官、血液及被节肢动物如蚊虫叮咬而感染，潜伏期一般为2 d～7d,我国尚未发现有此疾病。4缩略语下列缩略语适用于本文件。RT-PCR:反转录-聚合酶链反应实时荧光RT-PCR：实时荧光反转录-聚合酶链反应Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数RNA:核糖核酸FAM:FAM荧光染料，一种荧光报告基团5生物安全要求按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的要求，裂谷热病毒相关材料的生物安全要求1 SN/T 3559—2013如下:裂谷热病毒危害程度分类为第二类；裂谷热病毒相关的病毒培养和动物感染实验操作应在生物安全Ⅲ级（BSL-3或ABSL-3)实验室内进行；裂谷热病毒相关的未经培养的感染性材料的操作应在生物安全Ⅱ级(BSI-2)实验室内进行；裂谷热病毒相关的灭活材料及无感染性材料的操作可在生物安全I级（BSL-1）实验室内进行；一裂谷热病毒感染材料的运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。6标本的采集、运输和保存6.1　人血清无菌采集疑似病例发病3天内静脉血r3~mml-5-mt密温静置30mih使其凝固，500g离心10min，收集血清于2mL无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔登记编号，低温送到实验室检测。如24h内不能送到实验室，应将血清置于一70℃冰箱保存6.2蚊虫样本将收集于集蚊袋中的蚊虫连同集蚊袋起置于一20℃箱1h以炼死蚊虫，取出，分类编号，按30只～50只一组装人2mL螺口塑料管内旋紧管盖，翼液氮、干冰或--70℃冰箱中待检；蚊虫样本运输也应在液氮或干冰条件下进行，以防止其体内游毒核酸降解。7 标本的处理7.1样本前处理7.1.1 血清标本血清标本直接进行分子生物学核酸的提取，，如24h不能及时检测应存放在一70℃冰箱。7.1.2蚊虫样本从液氮、干冰或一70℃冰箱中取蚊虫样本：迅速置于预冷的玻璃研磨管中，加人1ml.Hanks液吹洗-次，弃去Hanks液，加人预冷的0.5uL样本处理液，反复研磨至组织碎片基本消失，然后迅速将研磨液吸人1.5mL无菌离心管中，置冷冻离心机中，4℃10000g离心10 min。取上清液进行核酸提取。7.2核酸提取7.2.1吸取140μul.血清样本或蚊虫样本研磨液加人溶解的560ul裂解液AVI。7.2.2脉冲混匀 15 s,置于室温 10 min。7.2.3短暂离心，加人560μL无水乙醇，脉冲混匀15 s。7.2.4短暂离心。7.2.5将QIAamp旋转柱置于2mL收集管中。从7.2.3中吸取630μL.溶液转移至旋转柱上，6000g离心1min,将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。7.2.6打开旋转柱盖，重复 7.2.5。7.2.7打开旋转柱盖，加入500uL洗液AW1，盖紧盖子，6000g离心1min。将旋转柱放至干净的收2 SN/T 3559—2013集管上，丢弃包含过滤液的收集管。7.2.8打开旋