SN_T 2732-2010牛瘟检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2732—2010牛瘟检疫技术规范Quarantine protocol for rinderpest2011-05-01实施2010-11-01 发布中华人民共和．国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2732—2010言前本标准依据 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：周晓黎、严树发、季新成、王振国、杨建明、花群义、叶玲玲、艾军。 SN/T 2732--2010牛瘟检疫技术规范1·范围本标准规定了牛瘟病毒的分离及鉴定、聚合酶链和酶联免疫吸附试验检测方法本标准适用于牛及其他反鱼动物牛瘟的诊断和流行病学调查。2　规范性引用文件凡是沣日期的引用文伴，仅注日期的版本适用于本文下列文件对于本文件的应用是必不可少的。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件GB/T18088出人境动物检疫采样3 疫病简介牛瘟是由牛瘟病毒引起,牛的急性高度接触传染性、病毒性疾病,以突然发病、高热、粘膜发炎坏山羊等反垒动物发病;猪可感染和传播本病(参见附引起死、病程短、死亡率高为主要特征。录A)。现场检验检疫X诊断。逐头进行临床检查,根据临床现和特异性病理变化5 采样按GB/T18088规定，逐头进待采样，并按规定填育《送样单》送实节6 诊断方法6.1　总则用分子生物学、血清学等方法可以对牛瘟作出初步诊断，而要确诊应进行病毒分离鉴定，特别是首次发生地区的病例。此外,对流行的牛瘟病毒的致病性、毒力及抗原性进行分析时，病毒分离鉴定也是最可靠的方法（病毒的分离及鉴定需在生物安全三级实验室进行）。6.2 病毒分离及鉴定6.2.1 材料和试剂毒株：采用冻干适应细胞培养的牛瘟鸡胚化弱毒株或牛瘟 Kabete0疫苗株6. 2.1.2 标准血清:牛瘟标准阳性血清、阴性血清。细胞：犊牛原代肾细胞或 B95a 猴类淋巴母细胞或非洲绿猴肾细胞(Vero)。 SN/T :2732-20细胞培养液、维持液、分散液配制见附录B：6.2:1,5无牛瘟病毒抗体犊牛血清(56.℃ 30 min灭能）。6.2:2仪器和设备6.2:2.1·乳钵或组织捣碎器、镊子、剪刀、冰箱。4、96孔细胞培养板、微量移液器、滴头、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。6.2:3样品的采集及处理6.2. 3. 1 : 样品的采集用肝素或乙二胺四乙酸二钠（终浓度分别为10IU/mL和0.5mg/mL)抗凝采集全血，充分混匀后，装冰盒(不冰结)送往实验室，分离出白血球进行牛瘟病毒分离。也可用死亡动物的脾脏、肩前或肠系膜淋巴结等样品(可冻结保存运输)进行病毒分离。6.2!3.2样品处理6.2:3.2.1°血液：5000r/min离心抗凝血15min，在血浆和红血球之间获得棕黄层，无菌取出，加人20 nL无菌生理盐水,洗涤离心，除去血浆中的所有中和抗体。用维持液重悬细胞沉淀物,接种敏感，细胞。6.2.:3.2.2组织：将样品剪碎用无血清培养液制成20%悬液，内含200IU/mL青霉素和链霉素，2.5μg/mL两性霉素B,置乳钵或组织捣碎器研磨，经2:000r/min离心20min，取上清液置-70℃保存备用。6.2:4接种敏感细胞·;按常规方法制备犊牛原代肾细胞、B95a绒猴类淋色母细胞、非洲绿猴肾细胞（Vero)。将制成的样品悬液接种长成单层的上述敏感细胞，每份病料接种两孔；每孔接种1mL，置37℃吸附1 h，细胞维持液洗涤2次,加细胞维持液1mL,至37℃.5%三氧化碳培养箱中培养。观察细胞病变(CPE)形成情况。.典型的病变是细胸变圆、萎缩、胞质间桥伸长(星状细胞)或形成合胞体。CPE形成的速度随病毒株的不同有所变化。..．培养.11d,若无CPE出现，则盲传两代，无CPE出现判为阴性，出现CPE则需进一步鉴定。.6. 2.i5°病毒鉴定6. 2.5.1病毒中和试验）.1病毒收获：收获出现CPE的病毒悬液，重新复壮，待 CPE达75%时，收获冻融 2:次～3次或经超声波处理，2000r/min.离心20min，取上清液，分装置一70℃保存备用。.2中和：将分离的病毒液在96孔板上用无血清维持液作10倍系列稀释（10-1～10-5），每个稀释度.4孔，每孔50μL,在其中两扎中加入等量的牛瘟标准阳性血清，另外两孔加人等量牛瘟标准阴性血清，37℃作用1h,每孔加人.100μL继代牛肾细胞或Vero细胞(2×10°/mL)悬液，置37℃,5%二氧化碳培养箱培养 11d。从第二天开始，每天观察。.3,结果判定:如果阴性血清