NY_T 2469-2013陆地棉品种鉴定技术规程 SSR分子标记法.pdf

ICS 65.020.01B 04NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2469—2013陆地棉品种鉴定技术规程SSR分子标记法Protocol for identification of cotton variety--SSR marker method2013-12-13 发布2014-04-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 2469--2013目次前言范围：12规范性引用文件3术语和定义4原理·5仪器设备及试剂6溶液配制7引物8参照品种及其使用..9操作程序10等位变异数据采集11判定方法仪器设备及试剂附录A（规范性附录）溶液配制·附录B(规范性附录)附录C(规范性附录）核心引物附录 D(资料性附录)参照品种名单12- NY/T 2469—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由农业部科技教育司提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院、农业部科技发展中心。本标准主要起草人：戴剑、王显生、丁奎敏、王艳平、徐鹏、冯继宏、陈二龙。I NY/T 2469-—2013是SSR分子标记法陆地棉品种鉴定技术规程1范围本标准规定了利用简单重复序列（simplesequencerepeats，SSR）分子标记进行陆地棉（GossypiumhirsutumL.）品种鉴定的试验方法、数据记录和判定标准。本标准适用于基于SSR分子标记法的陆地棉DNA分子数据采集和品种鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是未注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1核心引物coreprimer指品种IDNA指纹鉴定优先选用的一套SSR引物，具有多态性高、重复性好等综合特性，可用于品种DNA指纹数据采集和品种鉴定。3. 2参照品种referencevariety是对应于特定位点不同等位变异的一组品种，用于辅助确定待测样品在某个位点上等位变异扩增片段的大小，校正仪器设备的系统误差，以保证不同实验室数据具有可比性。4原理SSR广泛分布于基因组中，不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。针对两侧序列高度保守的简单重复序列.根据其两侧的序列设计一对特异引物，利用聚含酶链反应（polymerasechainreaction，PCR)技术对重复序列进行扩增。在电泳过程中，由于SSR位点重复单位的数量不同引起不同长度的PCR扩增片段在电场作用下分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定陆地棉品种。5仪器设备及试剂仪器设备及试剂见附录A。6溶液配制溶液配制方法见附录B。7 引物引物相关信息见附录C。8参照品种及其使用参照品种的名称见附录C，参照品种来源参见附录D。I NY/T 2469--2013在进行等位变异检测时.应同时包括相应参照品种的PCR扩增产物。注1：同-名称不同来源的参照品种的某-位点上的等位变异可能不相同.在使用其他来源的参照品种时，应与原参照品种核对.确认无误后再使用。注2：对于附录C中未包括的等位变异，应按本标准方法，确定其大小和对应的参照品种。9操作程序9.1样品准备每份样品检测8个单株.进行个体分析。9.2DNA提取9.2.1将种子发芽，取两片真叶期的真叶0.2g.放入1.5ml.离心管中。9.2.2置冷冻干燥仪中一50℃冷冻干燥2d.取出，每个试管中放入1个3mm直径的小钢珠，置研磨仪上设定每秒钟30次，研魔约5min。9.2.3加人预冷的新鲜配制的提取缓冲液600μl，冰浴10min。10000g，4℃，离心10min，弃上清液。9.2.4于沉淀中加人600ul.65℃预热的裂解缓冲液，搅拌均匀.65℃水浴40min，期间翻转混勾3次。9.2.5加人800μl.氯仿-异戊醇(V：V=24：1)混含液，翻转50次以上，10000g离心20min，将上清液转人一新的1.5mI.离心管中。9.2.6加0.6倍体积预冷的异丙醇（一20℃）缓慢翻转30次，混匀，静置10min，12000g离心15min，弃上清液。9.2.7于沉淀中加人1ml.70%的乙醇洗涤，12000g离心2min。9.2.8弃上清液，通风干燥沉淀。9.2.9加人200μI.TE缓冲液，溶解DNA.检测DNA浓度，一20℃保存备用。注：其他所获DNA质量能够满足PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本标准。9.3PCR扩增9.3.1