NY_T 2745-2015水稻品种鉴定SNP标记法.pdf

ICS 65.020.20B 05NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2745-2015水稻品种鉴定SNP标记法Protocol for identification of rice varieties--SNP marker method2015-08-01实施2015-05-21 发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 2745—2015目次前言-范围12规范性引用文件3术语和定义原理·45仪器设备及试剂溶液配制6T标记…操作程序89数据记录10判定方法附录A（规范性附录）仪器设备及试剂附录B(规范性附录)溶液配制，附录C(规范性附录)推荐标记 NY/T 2745--2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由农业部种子管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归口。本标准起草单位：中国水稻研究所、中国科学院国家基因研究中心、农业部科技发展中心。本标准主要起草人：魏兴华、韩斌、徐群、黄学辉、张新明、龚浩、冯跃、堵苑苑、余汉勇Ⅲ NY/T 2745--2015SNP标记法水稻品种鉴定1范围本标准规定了利用单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）标记进行水稻（OryzasativaL.）品种鉴定的操作程序、数据记录与统计、判定方法。本标准适用于水稻品种的SNP指纹数据采集及品种鉴定，2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB4404.1粮食作物种子禾谷类GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19557.7植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南水稻NY/T2594一2014植物品种鉴定DNA指纹方法总则3术语和定义NY/T2594—2014界定的术语和定义适用于本文件。4原理不同水稻品种的基因组DNA存在核苷酸序列差异，其中单个核苷酸（A、C、G、T)的替换引起的这种多态性差异，分布密度高而均匀、通量高、数据整合易，可通过扩增及芯片扫描等技术进行检测，从而能够区分不同品种。5仪器设备及试剂见附录A。6溶液配制见附录B。所用试剂均为分析纯。试剂配制用水应符合GB/T6682规定的一级水的要求，7标记标记相关信息见附录C。8操作程序8.1样品准备试验样品为种子时，其质量应符合GB4404.1中对水稻种子纯度的要求。种子样品的分样和保存，应符合GB/T3543.2的规定。每份样品检测至少50个个体（种子、叶片）的混合样。8.2DNA提取与检测取试样的幼苗或叶片200mg～300mg置于2.0mL离心管，加液氮充分研磨，每管加人700uL经 NY/T2745—201565℃预热的CTAB提取液；或直接将叶片剪碎放入2.0mL离心管，每管加人700uL经65℃预热的CTAB提取液，研碎。65℃水浴60min并多次颠倒混匀。每管加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1)混合液，充分混合后静置10min，12000r/min离心15min。吸取上清液转移至一新管，加人2倍体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，一20℃放置30min后在4℃、12000r/min离心10min，弃上清液，用70%乙醇溶液洗涤2遍，自然条件下干燥后，加人TE缓冲液充分溶解，检测浓度，一20℃保存留用。注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到后续操作质量要求的DNA提取方法都适用于本标准。8.3SNP指纹数据采集如下操作程序仅为推荐方法，其他能达到同样效果的方法也可采用。8.3.1全基因组恒温扩增取4uL样品DNA进行37℃全基因组恒温扩增。在样品板中加入反应液：包括样品DNA、dNTP、六核苷酸随机标记、phi29DNA聚合酶以及酶缓冲液，置于杂交炉，37℃恒温孵育22h；然后再65℃水浴10min使剩下的酶灭活。8.3.2芯片杂交杂交前准备样品板加入FMS试剂后，置于加热器，37℃孵育1h进行片段化处理。加入PM1试剂离心后再加人100%异丙醇进行沉淀晾干；加人RA1试剂并且封口后放人杂交炉，48℃孵育1h离心进行重悬。杂交样品板95℃变性20min后室温冷却30min，离心后各取12μL样品加人芯片加样区，置于杂交炉，48℃孵育16 h～24h。8.3.3芯片扫描杂交后，将芯片洗涤、扫描，进行数据分析处理；同时保存原始信号值文件。9数据记录根据SNP位点的分型效果，剔除或留用该位点的数据。数据记录为X/X或X/Y,其中X、Y为该位点的单核苷酸，如A、T、C、G,按此顺序排列。无效数据记录为一/一。一个样品的无效