SN_T 2975-2011鱼华支睾吸虫囊蚴鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2975--2011鱼华支辜吸虫囊鉴定方法Identification for metacercaria of Clonorchis sinensis in fish2011-09-09 发布2012-04-01实施中华人民共和布国家质量监督检验检疫总局3B数码防伪 SN/T 2975-2011前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局检验检疫技术中心、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。本标准主要起草人：陈信忠、郭书林、陈韶红、龚艳清、李树清、杨俊萍、陈飞、陈家旭、张仪、徐淑菲、孔繁德、胡薇、黄燕。I SN/T 2975—2011鱼华支睾吸虫囊坳鉴定方法范围1本标准规定了鱼体内华支睾吸虫囊坳的压片检查法、蛋白酶消化法以及PCR鉴定方法。本标准适用于鱼类华支睾吸虫囊蚜的病原鉴定及其流行病学调查和监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验旁法基因检验实验室技术要录SN/T 1193 3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1囊蝴metacercaria中间宿主后或附着水生植物上，脱掉复殖吸虫幼虫发育中的一吸虫尾进人第二个阶段尾部，躯干部变圆，头腺分泌囊壁而成为具有感染能力的囊。3.2中间宿主intermediate host寄生虫在幼虫或无性生殖时期所寄生的宿生。华支睾吸虫的幼虫需要经过两个中间宿主，第一中间宿主包括多种淡水螺，第二中间宿主包括多种淡水鱼类和虾类。3.3终末宿主definitive host寄生虫成虫或有性生殖阶段所寄生的宿主。华支睾吸虫的终末宿主主要包括人、犬、猫、猪等哺乳动物。4试剂和材料4.1所有化学试剂均为分析纯。实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格，用于 DNA 提取及PCR实验的水需用灭菌双蒸水。PCR 实验应在符合 SN/T 1193 要求的实验室进行。Taq 酶、dNTPs（含dATP、dUTP、dCTP、dGTP)等核酸提取及PCR所需试剂可选用商品化试剂和试剂盒。4.2阳性对照为华支睾吸虫囊坳或成虫。4.3PCR 正向引物 CS1:5-CGAGGGTCGGCTTATAAAC-3反向引物 CS2:5-GGAAAGTTAAGCACCGACC-34.4胃蛋白酶消化液（见A.1)。4.5盐酸卡红染液（见 A.2)。 SN/T 2975-20114.6盐酸酒精分色液（见A.3）。4.7 CTAB溶液(见 A.4)。4.8抽提液1（见 A.5）。4.9抽提液2(见 A.6)。4.10TBE电泳缓冲液(见 A.7)。4.11 本核酸染色剂（EB)（见 A.8）。4.12上样缓冲液（见 A.9)。4.13甲醛、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、中性树脂。5器材和设备5.1 PCR仪。5.2显微镜(具目镜测微尺）。5.3立体显微镜。5.4 高速离心机。5.5切片机和切片器具。5.6解剖器具。5.7 微量移液器。5.8 染色缸。5.9载玻片和盖玻片。6鱼体内华支睾吸虫囊蜘的诊断6.1显微镜检查方法6.1.1压片检查法淡水鱼类为华支睾吸虫的第二中间宿主，囊坳可寄生于鱼体的肌肉、皮、头、鳃、鳍及鳞等各部分，尤其在鱼体中部的背部和尾部肌肉较多。在鱼体背部及肛区至尾鳍的基部各取约2g肌肉，放在两张载玻片之间，用力压薄，用棉线扎紧玻片两端。将玻片放在低倍显微镜下观察，检查各种襄蜘。新鲜鱼肉中华支睾吸虫囊坳一般为椭圆形，大小(90 μm～110 μm)×（100μm～140 μm）,其外有一层鱼组织反应所产生的纤维层，龚壁分两层，外壁较厚，内壁较薄，囊内有一卷曲的活动的，可见口吸盘和腹吸盘，腹吸盘下方为一椭圆形充满黑色颗粒的排泄。在鱼肉中检查到具备上述特征的囊坳，可初步判定为华支睾吸虫囊坳。6.1.2蛋白酶消化法取鱼体背、腹两侧及尾部肌肉，用剪刀剪碎。取5g鱼肉，置于烧杯中，用50mL胃蛋白酶消化液（见A.1)充分混匀后置37℃温箱消化过夜。消化后的悬液用40目铜筛过滤，滤液用生理盐水洗涤沉淀3次～5次。全部沉淀分次吸人玻璃平血，用解剖镜检查沉淀中的囊坳。按观察囊蜘，并初步判定结果。6.1.3囊蜥标本制作方法按6.1.1或6.1.2方法采集囊坳。2 SN/T 2975—20囊坳用两张载玻片夹捆，不要用力压挤，以免囊坳变形，用8%福尔马林固定2d。取出囊，用自来水冲洗2 min。用30%、40