SN_T 3711-2013桤树黄化植原体检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3711—2013树黄化植原体检疫鉴定方法Detection and identification of alder yellows phytoplasma2013-11-06 发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3711—2013前 言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中国检验检疫科学研究院、中国农业大学。本标准主要起草人：冯建军、牟海青、郑耘、赵文军、龙海、王红英、罗来鑫、李健强、章桂明。 SN/T 3711-2013档树黄化植原体检疫鉴定方法1 范围本标准规定了档树黄化植原体的检测鉴定方法。本标准适用于树苗木等繁殖材料或产品中树黄化植原体的检疫和鉴定。2档树黄化植原体基本信息英文名：Alderyellowsphytoplasma分类地位：软璧菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes），非固醇菌原体目（Acholeplasmatales），非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（CandidatusPhytoplasma），榆树黄化植原体群A亚组(16SrV-A)。远距离传播主要途径为带菌苗木。杷树黄花植原体近似种主要包括榆树黄花植原体群A亚组（16SrV=A)的其他三种植原体，即榆树黄花植原体、榆树丛枝植原体、悬钩子矮化植原体。其他背景资料参见附录A。3方法原理树黄化植原体的寄主范围、症状特点、16SrDNA序列及其RFLP指纹图谱分析等方法是检测鉴定该植原体的主要依据。4仪器、用具及试剂4.1仪器PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、台式冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、电泳仪和凝胶成像系统4.2用具可调移液器（最大量程为20μL、200μL、1000μL）及相关吸头、研钵、离心管（2mL）、PCR管、量筒、烧杯、酒精灯和镊子等。4.3试剂具体试剂见附录B和附录C。5检测鉴定方法5.1症状观察现场对树苗木进行症状观察，症状描述参见附录A中A.3，挑取可疑症状植株样品带回实验室1 SN/T 3711—2013检测。5.2样品DNA提取具体步骤见附录B中B.3。5.3通用引物PCR扩增利用两对通用引物通过巢式PCR扩增植原体16SrDNA，方法见附录C。5.4PCR产物的克隆与测序分析将PCR产物进行克隆测序，将所得DNA序列输人GenBank进行BLAST比对检索，采用生物信息学软件对所得到的DNA序列与GenBank中其他相关植原体序列进行比较和分析，并构建系统发育树。5.5PCR产物的序列虚拟RFLP分析利用iPhyclassifier在线软件(/cgi-bin/resource/iphyclassi-fier.cg)或DNA-FPCluster软件，分别用限制性内切酶Alul，BamHI，Bfal，BstUI，DraI，EcoRI，Hae,HhaI,HinfI,HpaI,HpaII,Kpnl,Mbol,MseI,RsaI,SspI,Taql对样品16S rDNA(R16F2n/R16R2)扩增产物序列进行虚拟RFLP酶切，其图谱与树黄化植原体标准酶切图谱（见附录D.2）比对分析。6结果判定当待检测样品的症状与描述相一致（或样品无显症），其植原体16SrDNA巢式PCR扩增产物具有约1248bp的片段，且序列RFLP图谱分析结果与树黄化植原体模拟标准图谱一致，可判定该植物样品携带树黄化植原体。7样品保存与复核7.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出树黄化植原体的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。7.2结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳图。2 SN/T3711—2013附录A（资料性附录）档树黄化植原体相关资料A.1英文名AlderyellowsphytoplasmaA.2中文名树黄化植原体A.3为害症状该植原体病害最典型症状为树木叶片稀疏、发黄、变小（见图A.1)，严重时死亡。树木的各生长阶段均可感病，但有时无明显症状。图A.1恺树黄化植原体为害症状A.4寄主范围主要寄主是木属，包括粘胶木（Alnusglutinosa）、红木（Alnusrubra）等树种。在自然条件下，长春花（Catharanthusroseus）也是恺树黄化植原体的寄主。A.5传播途径档树黄化植原体近距离传播主要由取食植株韧皮部的介体昆虫传播，如档树广头叶蝉