SN_T 4826-2017禽螺旋体病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4826—2017禽螺旋体病检疫技术规范Quarantine protocol for Avian Spirochaetosis2017-07-21 发布2018-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局站w315.c刮漆层查真伪 SN/T 4826--2017前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘生峰、杨俊、陆丽华、聂福平、王昱、张雷、李贤良、王国民、李应国。 SN/T 4826—2017禽螺旋体病检疫技术规范1范围本标准规定了禽螺旋体病的病原分离与鉴定、聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光PCR 和酶联免疫吸附试验(ELISA)的检测技术。本标准适用于禽螺旋体病的检疫或流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3缩略语下列缩略语适用于本文件。AS:禽螺旋体病B.B:伯氏疏螺旋体BSK-H:BSK-H 培养基(Barbour-Stonner-Kelly-H medium)ELISA：酶联免疫吸附试验PBS:磷酸缓冲液HRP:辣根过氧化物酶OD值：光密度值PCR:聚合酶链式反应BSA:牛血清白蛋白dNTPs:脱氧核苷酸SDS:十二烷基硫酸钠4:疫病概述禽螺旋体病（Avian Spirochaetosis，AS)是由伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）引起的，可致多种禽类感染的以发热、精神沉郁、厌食和下痫为其特征的急性败血性传染病。伯氏疏螺旋体属于原核生物界（KingdomMonera）、螺旋体目（Spirochaetidae）、螺旋体科（Spirochaetaceae）、疏螺旋体属（Borrelia）（也称包柔氏螺旋体属）。禽螺旋体病呈世界性分布，我国农业部和质检总局发布的《进境动物检疫疫病名录》,将其列人二类进境动物疫病,欧洲发生较多。我国新疆(1983年)曾有发生过鸡螺旋体病的报道。其流行病学、临床及病理变化参见附录 A。5样本采集5.1试剂和材料5.1.1主要试剂：BSK-H 培养基(见附录 B)、吉姆萨染液、革兰氏染液、生理盐水、甲醇。1 SN/T 4826--20175.1.2主要仪器设备和器材：无菌剪刀、镊子、平Ⅲ、烧杯、玻璃瓶、组织研磨器、注射器、离心机、高压灭菌锅、冰柜、生物安全柜、生物显微镜等。5.2病料的采集、保存和运输病料从发热或发病活禽及滨死禽中采集。对于活禽可用翼静脉采血，分离血清用于抗体的ELISA检测，用肝素钠为抗凝剂无菌采集抗凝全血用于病原分离试验。对于病、死禽应无菌采集小肠、脾、肝、肾、心、肺等组织脏器。采样后应立即处理（见6.1），若暂时不能处理，可于70℃冰柜中保存。样品的保存和运送按SN/T2123进行操作。6 病原分离与鉴定6.1组织样品的处理将组织样品2g,无菌接种至装有7mL BSK-H培养基的 10mL具塞试管中，32℃～33℃增殖培养7d后,取菌悬液涂片镜检。血液样品处理;取待凝血经 1 000 r/min离心10 min后,取血清及血细胞交界处淡白色悬液涂片镜检。6.2病原显微镜检取6.1的待检悬液数滴到载玻片中央，用接种环将悬液均匀涂布在载玻片上形成液膜，待液膜干燥后，用甲醇固定2min～3 min。滴加稀释好吉姆萨染液使全部覆盖玻片，室温染色15min～30 min后，用蒸馏水从玻片一端冲洗，晾干后镜检。也可经革兰氏染色后镜检。7 PCR7.1试剂和材料7.1.1主要试剂：液氮、十二烷基硫酸钠（SDS）、蛋白酶K、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、PCR反应缓冲液、Taq DNA 聚合酶、dNTP、琼脂糖、DNA marker。7.1.2主要仪器设备和器材：研钵、PCR仪、离心机、电流仪、电泳槽、凝胶成像系统、一20℃冰箱。7.1.3样品及处置：对脏器组织样品取约2g，置人无菌研钵中，加液氮研磨后，取匀浆液200μL置人1.5 mL离心管中;对 6.1中增菌悬液取200 uL～500μL置人1.5 mL离心管中;对血液样品,取待凝血经1000r/min离心10min后，取血清及血细胞交界处淡白色悬液200μL～500 μL置入1.5mL离心管中。对离心管中收集物经12000r/min离心10min后弃上清，收集沉淀用于提取核酸；同时设立伯氏疏螺旋体标准菌株培养物作为阳性对照；SPF鸡血为阴性对照。7.2引物和序列引物和序列如下：-P1:5-CTTCTCAAGG