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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3888--2014入出境动物皮张携带鼠疫耶尔森氏菌快速检测方法Rapid detection of Yersinia pestis from entry-exit animal skins2014-08-01实施2014-01-13发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局谐
SN/T 3888—2014前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。本标准主要起草人:乔舜、魏怀波、田丽、葛润平、郭文霞、王东胜、郝广福、张胜。I
SN/T 3888--2014入出境动物皮张携带鼠疫耶尔森氏菌快速检测方法1范围本标准规定了人出境动物皮张携带鼠疫杆菌的样本采样、保存及反相间接血凝试验和聚合酶链反应试验的快速检测方法。本标准适用于人出境旱獭、狐狸、狼、翁、鼠;灰鼠等可能感染鼠疫杆菌的动物皮张及寄生物的病原体检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。‘凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求WS 279鼠疫诊断标准国务院令第424号病原微生物实验室生物安全管理条例3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.13.动物皮张‧animal skins可能携带鼠疫杆菌的旱獭皮狐狸皮.狼皮、猪皮、麝鼠波灰鼠皮等。4实验室条件及防护要求4.1准则检测标本的处理和保存应在 BSL-2级以上实验室中进行。BSL-2级以上实验室的要求要符合GB19489和《病原微生物实验室生物安全管理条例》中同级别实验室的要求,并按照以上两个文件的要求来进行个人防护。检测方法主要参考 WS 279。4.2个人防护采用实验室二级防护标准。4.3实验仪器设备生物安全柜、DNA扩增仪、凝胶成像分析系统、电泳仪、高压灭菌器、电子天平、水浴锅、恒温箱、V孔板、移液器、不锈钢剪刀、打孔器。1
SN/T 3888—20145样本的采集和保存5.1梳检寄生物在大白盆内(或 1 m×1 m 的白布单)梳检寄生物,将检到的寄生物置于样品管内保存。5.2取样部位选择待检皮张的头颈部、尾部、四肢各个部位,有血液、淋巴结附着部位优先采样。5.3取样方法每张皮张按头颈部、四肢、尾部不同部位分别取1cm²大小的样本6块,用10cm×15cm塑料封口袋保存;血渍、淋巴结的部位用刀片刮取血渍,于10 mL带盖离心管内保存。5.4样本存放采集到的样本放置于一20℃冰柜或低温冰箱中冷冻保存,待检。5.5样本处理5.5.1反相间接血凝试验(Reverse indirect hemagglutination assay,RIHA)样品处理方法粉碎样本,加生理盐水浸没,浸泡24h。吸取浸泡液1500r/min离心5min,吸取上清液,56℃灭活 30 min后制成样液,备检。5.5.2聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)试验样本处理方法取1g龙胆紫,先用2mL酒精溶解后,加蒸馏水至100 mL,混匀,取此溶液10mL加人90mL蒸馏水制备成1g/L龙胆紫液;取2gNaCl加人100mL蒸馏水中,取此液100 mL加人1g/L龙胆紫液0.5mL,混匀后,分装高压灭菌30 min,配制成洗蚤液备用。粉碎样本,用双蒸水浸没,浸泡24h。吸取浸泡液1500r/min离心5min,吸取上清液,56℃灭活30 min后制成样液,备检;蚤、蜱、螨等寄生物样本置于研蚤板U孔内,用洗蚤液反复清洗干净,弃去清洗液,研磨后用生理盐水按照100 μL/只蚤(螨)、500μL/只蜱比例制成悬液,1500 r/min离心5min,吸取上清液,56℃灭活30min后制成样液,备检。6检测方法6.1反相间接血凝试验(RIHA)6.1.1试剂1%鼠疫F1抗体致敏血球。抑制剂为1:100稀释的鼠疫免疫血清。阳性对照血清:阴性混合血清加F1抗原至1mg/mL,1:100稀释后作为阳性对照。6.1.2标本准备按照5.5.1准备标本。2
SN/T 388820146.1.3初筛试验操作步骤每份被检液在V型孔微量血凝板稀释5孔。用移液器向每孔分别加人25μL稀释液。在第1孔中加入被检液25μL,吸排4次~6次,充分混匀,取25μL移至第2孔,充分混匀,依次稀释至最后一孔,弃掉 25 uL分别在各孔内加人1%鼠疫F1抗体致敏血球25μL,振荡混匀。置 37℃温箱或室温2h后观察结果。6.1.4结果判定“#”:凝集血球铺满孔低,有明显折边,抗体过量时,凝集呈疏松花圈状。“十十十”:凝集血球铺满孔低,
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