SN_T 2729-2010马铃薯炭疽病菌检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2729—2010马铃薯炭疽病菌检疫鉴定方法Detection and identification ofColletotrichum coccodes (Wallr. )Hughes2010-11-01 发布2011-05-01实施中华人民共和国33发布国家质量监督检验检疫总局政码防伪 SN/T 2729-—2010前言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘伟、刘会梅、封立平、王秀芬、姜丽、王有福、董薇。I SN/T 2729—2010马铃薯炭疽病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了进境马铃薯块茎以及携带土壤中马铃薯炭疽病菌的检疫和鉴定方法。本标准适用于马铃薯块茎以及携带土壤中马铃薯炭疽病菌的检疫和鉴定。2　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1块 tuber地下茎末端肥大成块状，适应储藏和越冬的变态茎。2.2acervulus分生孢子盘由基质表面突起的盘状菌丝块结构,其上生出密集的短分生孢子梗，分生孢子梗之间常生有刚毛。2.3刚毛setae一种较坚硬的毛状物，常壁厚，且颜色较暗。2. 4菌核sclerotium菌核是由菌丝紧密交织而成的休眠体，内层是疏丝组织，外层是拟薄壁组织，表皮细胞壁厚、色深、较坚硬。菌核的功能主要是抵抗不良环境。但当条件适宜时，菌核能萌发产生新的营养菌丝或从上面形成新的繁殖体。2.5附着孢appressorium植物病原真菌孢子萌发形成的芽管或菌丝顶端的膨大部分，可以牢固地附着在寄主体表面，其下方产生侵人钉穿透寄主角质层和表层细胞壁。3原理3.1马铃薯炭疽病菌的分类地位马铃薯炭疽病菌 Colletotrichum coccodes（Wallr.）Hughes 的中文名称为“墨色刺盘孢”。Colleto-trichum 为子囊菌、小丛赤壳属（Glomerella）的无性型。根据《Dictionary of Fungi》第 ９版，Colletotrichum分类地位为真菌界，有丝分裂孢真菌 Mitosporic fungi。3.2检疫和鉴定原理马铃薯块茎被马铃薯炭疽病菌侵染后出现圆形的病斑，在马铃薯块茎、匍匐茎、根、地上及地下茎变色的部位都能形成大量黑色的小菌核。本标准以该病菌在马铃薯块茎上的主要危害症状、形态学特征以及PCR反应特性为鉴定马铃薯炭疽病菌的主要依据。马铃薯炭疽病菌的形态特征及背景资料参见s SN/T 2729—2010附录 A。4仪器设备和用具4.1仪器设备超净工作台、高压灭菌锅、光照培养箱、体式显微镜、生物显微镜、冰箱、PCR仪、凝胶电泳仪、台式冷冻离心机、台式小型离心机、Mini离心机、水浴培养箱、制冰机、旋涡振荡器、电泳仪、恒温水浴锅、紫外反射透射仪、低温冰箱（一80℃）、凝胶成像系统、研磨珠均质器、空层析柱、天平（感量0.001g）。4.2　用具白瓷盘和尖头镊子、可调微量加样器、液氮罐、PCR反应管、研钵\玻璃珠、螺帽管、培养皿血、离心管、酒精灯、三角瓶(50mL，100 mL)）量筒（500 mL）、载玻片（25.3mm×76.2mm）、盖玻片（18 mm×18mm）、手术刀、手术剪、镊子、pH计、塑料袋离心管等。5 试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂次氯酸钠-吐温-20（Tween-20）、三氨基甲烷、EDTA、酚、异戊醇、氯化钾、4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）、溴化乙锭(EB)、RNase酶、蛋白酶K、BSA、PVPP、PVP、异丙醇、三氯甲烷、饱和酚、巯基乙醇、山梨糖、溴酚蓝、硫酸氨、CTAB、Biolase Diamond、SDS、葡萄糖凝胶 SephadexG-75、多聚半乳糖醛酸-PGA、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、山梨糖。抗菌剂：五氯硝基苯 PCNB、苯菌灵、硫酸链霉素、四环素盐酸氯霉素~红霉素、硫酸新霉素、扑海因、氯苯密醇、乙烯菌核利。1XTBE缓冲液、上样缓冲液TE缓冲液、菌丝体DNA提取缓冲液、均质缓冲液、土壤和块茎DNA提取缓冲液 SPCB、1XPCR 反应缓冲液。6现场检疫6.1 抽样6.1.1 #抽样方法以批为抽样单位，无批号的以品种为抽样单位。每份样品的抽样点不少于5个，随机抽取。单位包装只能有一个抽样点。6.1.2抽样数量500粒以下取-份；501粒～2000粒取两份；2001粒～5000粒取三份;5001粒～10000粒取四份；10001粒以上，每增加10000粒增取一份，不足10000粒的余量，计取一份。每份样品20粒块茎。6.2查验按进口马铃薯块茎总件数的5%～20%随机抽检，最低抽检数量不少于10件，且不少于1000粒。根据