SN 1444-2004大鼠流行性出血热间接免疫荧光试验.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1444—2004大鼠流行性出血热间接免疫荧光试验Indirect immunofluorescent antibody technigue for epidemichemorrhagic fever of rats2004-06-01发布2004-12-01实施中华人民共和国发布-15香国家质量监督检验检疫总局数码防伤 SN/T 1444—2004前 言本标准的附录 A是规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：胡永强、李树清、王巧全、徐红。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1444-2004大鼠流行性出血热间接免疫荧光试验范围本标准规定了间接免疫荧光试验检测大鼠流行性出血热抗体的方法。本标准适用于大鼠流行性出血热的检疫、流行病学调查和免疫监测。2 材料2. 1 试剂2.1.1磷酸氢二钠(NazHPO·12H2O)。2.1.2 磷酸二氢钾(KH2PO4)。2.1.3氯化钠(NaCl)。2.1.4伊文斯蓝。2. 1.5 甘油。1mol/LpH7.4磷酸缓冲液、0.01%~0.02%伊文斯蓝液和90%甘油缓冲盐水的配制见附录A。注；所有化学试剂均为分析纯。2.2仪器设备2.2.1单通道可调移液器及加样头。2.2.2染色缸。2.2.3保湿盒。2.2.4盖玻片。2.2.5恒温箱。2.2.6低温冰箱。2.2.7酸度计。2.2.8荧光显微镜。2.3标准试剂2.3.1多孔流行性出血热病毒抗原片（一20℃保存)。2.3.2流行性出血热阳性血清。2.3.3流行性出血热阴性血清。2.3.4异硫氰酸荧光黄(FITC)标记的兔抗大鼠IgG荧光抗体。3采样被检大鼠无菌采血 0.5 mL～1.0 mL,待血液凝固后,以 2 000 r/min离心10 min,分离血清。血清经56℃30min灭活后，置一20℃保存备用。4操作方法4.1准备抗原片从低温冰箱中取出流行性出血热病毒细胞抗原片，冷风吹干。 SN/T 1444—20044.2稀释血清将被检、阳性及阴性血清 1：20稀释。分别取 0.1 mL加人0.01 mol/L pH7.4 磷酸缓冲液1.9 mL,混匀。4.3加样抗原片编号后，取1：20稀释的被检血清10uL加人病毒抗原片孔内，每张抗原片均设阴性血清、阳性血清对照及标本自发荧光对照。阴性血清、阳性血清也与被检血清同样取 10 μL加人病毒抗原片孔内,标本自发荧光对照在对照孔内加人0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液10 μL。4.4反应抗原片置湿盒内，37℃恒温孵育30min。4.5洗玻片取出抗原片,用 0.01 mol/L pH7.4磷酸缓冲液(中间更换一次)振荡洗涤三次,每次 5 min。再用蒸馏水漂洗一次，冷风吹干。4.6稀释荧光抗体用0.01%～0.02%伊文斯蓝液稀释FITC标记的兔抗大鼠IgG荧光抗体至工作浓度。4.7加荧光抗体抗原片中每孔加人10μL工作浓度的荧光抗体。4.8反应按4.4操作。4.9洗玻片按4.5操作。4.10观察结果在抗原片上滴加90%甘油缓冲盐水，封片置荧光显微镜下观察结果。5结果判定5.1判定方法在荧光显微镜下观察，正常组织细胞被染成红色。细胞内病毒特异性免疫荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。出血热病毒的特异性荧光一般是散在的针尖大小的细颗粒,但亦可为粗颗粒、团块，甚至片状荧光。5.2 对照5.2.1自发荧光对照：无荧光，细胞被染成红色。5.2.2阴性血清对照：无荧光，细胞被染成红色。5.2.3阳性血清对照:细胞内病毒特异性免疫荧光闪亮,呈针尖状或片状。5.3检测样本判定对照系统成立方可进行判定。被检样本细胞浆内无荧光,细胞被染成红色判为阴性反应；被检样本细胞浆内出现明显黄绿色荧光颗粒,判为阳性反应。2 SN/T 1444—2004附录A（规范性附录）试剂配制A.11/15 mol/L磷酸氢二钠的配制称 NazHPO4·12H,023.876g，加蒸馏水溶解后定容至1000mL。A.21/15 mol/L磷酸二氢钾的配制称KH²PO49.074 g,加蒸馏水溶解后定容至1000 mL。A.3生理盐水的配制称8.5 g NaCl加蒸馏水溶解后,定容至 1 000 mL。A.40.01 mol/L pH7.4磷酸缓冲液的配制1/15 mol/L磷酸氢二钠81l mL1/15mol/L磷酸二氢钾19mL生理盐水566 mL用酸度计测定pH,并用1/15mol/L磷酸盐液校正至pH7.4。A.50.01 mol/L pH7.2 磷酸缓冲液的配制1/15mol/L磷酸氢二钠73mL1/15 mol/L磷酸二氢钾27mL生理盐水566 mL用酸度计测定p