SN_T 4276-2015国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4276—2015国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测方法Detection of Yersinia pestis in rodents by real-timePCR method at frontier port2015-05-26 发布2016-01-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局40C098215:5刮涂层查真伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光PCR 检测方法SN/T 4276—2015*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029)北京市西城区三里河北街16号（100045)总编室：（010址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×123001/16印张 0.5字数 11 千字2016年1月第一版反　2016年1月第一次印刷印数1—1100*书号：155066·2-29605 SN/T 4276—2015前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、北京市海淀区疾病预防控制中心、中华人民共和国福建出人境检验检疫局。本标准主要起草人：田洁、陆琳、郭惠琳、何斌、刘艳华、任彤、赵静、黄恩炯。1 SN/T境口岸鼠疫耶尔森菌荧光PCR 检测方法1范围本标准规定了国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测方法的检测对象，标本的采集、处理、检测程序。本标准适用于国境口岸鼠疫耶尔森菌的荧光PCR检测，2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489　实验室　生物安全通用要求GB/T 28940病媒生物感染病原体采样规程鼠类GB/T28942病媒生物感染病原体采样规程蚤SN/T1240　国境口岸鼠类监测规程SN/T1292　国境口岸蚤类监测规程WS 279鼠疫诊断标准人间传染的病原微生物名录（卫生部）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1Yersinia pestis鼠疫耶尔森菌俗称鼠疫杆菌，为革兰阴性短粗杆菌，菌体两端钝圆且浓染，亦易被苯胺染料着色，大小为(0.5μm～1.0 μm）X（1.0 μm～2.0μm）。一般分散存在，偶尔成双或呈短链排列,无鞭毛，不形成芽胞。鼠疫耶尔森菌是鼠疫的病原菌，鼠疫是一种人兽共患的自然疫源性烈性传染病，人类鼠疫多为疫鼠的跳蚤叮咬而感染，是我国法定的甲类传染病。鼠疫传染性强，病死率高，易酿成大流行。鼠疫耶尔森菌主要累及皮肤和淋巴结,其次为败血症、肺炎、脑膜炎。4缩略语下列缩略语适用于本文件。PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)Ct值：循环阈值，每个反应管的荧光信号达到设定阙值时所经历的循环数（cycle threshold)DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid)PBS缓冲液1 SN/T 4276—2015含0.5%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液。生理盐水0.9%的氯化钠水溶液。5实验室生物安全要求按照《人间传染的病原微生物名录》规定，本方法中鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测应在GB19489规定的生物安全Ⅱ级（BSIL-2)实验室内进行。6检测对象6.1国境口岸疑似鼠疫耶尔森菌感染者的临床样品。6.2‧国境口岸可能携带鼠疫耶尔森菌的医学媒介生物样品。6.3国境口岸疑似鼠疫耶尔森菌污染的环境样品。7主要仪器设备本方法使用的主要仪器如下：实时荧光 PCR 仪；二级生物安全柜；高压灭菌器；一70℃超低温冰箱（或液氮罐）；普通冰箱;高速台式冷冻离心机（最高转速13800g以上）；微量可调移液器（10 μL、200 μL、1000μL)及配套的一次性带滤芯吸头；水浴锅；组织研磨器。8 试剂本方法使用的主要试剂如下：无菌生理盐水或三蒸水；-Premix Ex TaqTM (Probe qPCR)!) ;引物；-阳性对照；阴性对照;探针。1）给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。2 SN/T 4276--20159检测程序9.1样本采集鼠类样品的采集、运输和保存按照GB/T28940、SN/T1240操作；蚤类样品的采集按照9.1.1[GB/T 28942、SN/T 1292 操作。9.1.2临床样品的采集按照WS279操作。9.1.3环境样品按无菌技术操作，取适量置于无菌容器中密封保存。9.1.4在采集过程中做好个人防护。9.2样品检测9.2.1核酸提取煮沸法提取核酸.1以无菌方法称