SNT 1905-2007牛病毒性腹泻/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1905-2007牛病毒性腹泻/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程Protocol of reverse transcription polymerase chain reactionfor bovine viral diarrhea/mucosal disease2007-12-01实施2007-05-23发布中华人民共和国发布表余层拨19815查试真伤国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1905—2007前 言本标准的附录 A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。本标准主要起草人：王伟利、王振国、刘金华、孟日增、肖成蕊、石建平、牟峻、逢奎春、杨伟、赖少梅。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。·1i一！ :一一- SN/T 1905--2007牛病毒性腹泻/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程1 范围本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病病毒反转录聚合酶链式反应检测方法。本标准适用于牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的检测2规范性引用文件凡是注日期的引用文件,其随后所有下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3原理根据牛病毒性腹泻/粘膜病病毒基因组5^端非编码区最保守的核苷酸序列，设计合成一对特异性引物，利用反转录聚合酶链式反应技术分别采用一步法和两步法从各种样品中扩增牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的特异性片段,该片段既可用于病毒性腹泻/粘膜病病毒基因分型又可以区别于其他瘟病毒属成员。4设备和试剂4.1主要仪器和设备4.1.1PCR扩增仪。4.1.2低温高速离心机、微量高速离心机。电泳仪、电泳槽。4. 1.34. 1. 4凝胶成像分析系统。4. 1.5 冰箱。4.1.6超净工作台。4.1.7组织匀浆器。4.1.8二氧化碳培养箱。4.2试剂和耗材4.2.1水：所用水应符合GB/T6682中三级水（三蒸水）的规格。用于PCR（尤其核酸提取）的水要用DEPC处理以除掉RNA酶，配制方法见第A.1章。4.2.2营养液：配制方法见第A.2章。4.2.3维持液：配制方法见第A.3章。14.2.4细胞分散液：配制方法见第A.4章。4.2.5化学试剂：所有的化学试剂均为分析纯。Catrimox-14（Cat-14）、硫氰酸胍、酚、三氯甲烷、柠檬酸钠、正丁醇、乙酸钠、乙醇、异丙醇（一20℃预冷）。4.2.6其他试剂:RT-PCR Beads（反转录酶）或 AMV 反转录酶（5 U/μL）、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、dNTPs(每种浓度均为10 mmol/L）、RNasin（40 U/μL）、MgCl²（15 mmol/L）、琼脂糖（电泳级）、 .-1SN/T 1905--200711DNA Marker DL20050×Tris-冰乙酸（TAE)电泳缓冲液：配制方法见第A.5章4.2.810mg/ml.溴化乙锭溶液：配制方法见第A.6章。4.2.91%琼脂糖凝胶：配制方法见第A.7章。14.2.10引物:根据病毒性腹泻/粘膜病病毒(BVDV)国际标准株基因序列,在其最保守的 5端非编码区序列设计合成一对特异性引物：5’-AGGCTAGCCATGCCCTTAGT-3’，5’-TCTGCAGCACCCTATCAGG-3配制成 20 μmol/I，一20℃保存。4.2.11 可调微量移液器(20 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、2 μL～20 μL、0.5 μL～10 μL)。 mI.、0.2 mI离心管和吸头（用 DEPC 水处理后高压灭菌备用，处理方法见第 A.8 章）4.3标准毒株和细胞4.3.1标准毒株：以BVDV国际标准毒株 NADL株或Oregon C24V株为试验的参照病毒株。4.3.2细胞：按常规方法取健康新生犊牛睾丸，制备原代睾丸细胞。5阳性对照样品和阴性对照样品5.1阳性对照样品由指定单位提供或按下列方法制备：将牛病毒性腹泻-粘膜病国际标准毒株按10%接种原代睾丸细胞，于.37℃吸附1h后加人维持液，37℃培养,待 CPE达到 70%时收获病毒悬液：冻融 2次～3次，5 000 r/min 离心10 min，取上清液备用。5.2阴性对照样品由指定单位提供或按下列方法制备：将生长良好的原代睾丸细胞，冻融2次～3次，5000 r/min离心10 min,取上清液备用。6试验方法6.1样品的处理6.1.1组织样品：包括从肠粘膜刮取的物