SN_T 4877.7-2017基因条形码筛查方法 第7部分：检疫性轮枝菌.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4877.7-—2017基因条形码筛查方法第7部分：检疫性轮枝菌DNA barcoding screening method--Part 7 :Quarantine Verticillium2017-08-29 发布2018-04-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局举 SN/T 4877.7-2017前言SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；第2部分：检疫性黄单胞菌；第3部分：检疫性植原体；一第4部分：检疫性茎点霉；第5部分：检疫性拟茎点霉；-第6部分：检疫性嗜酸菌；第7部分：检疫性轮枝菌；第8部分：检疫性炭疽菌；一第 9部分：检疫性腥黑粉菌;第10部分：检疫性疫霉。本部分为 SN/T 4877的第7部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本部分起草人：高瑞芳、章桂明、汪莹、程颖慧、王颖、卢小雨、向才玉、潘广。1 SN/T 4877.7--2017基因条形码筛查方法第7部分：检疫性轮枝菌1范围SN/T 4877的本部分规定了棉花黄萎病菌和首黄萎病菌DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。本部分适用于检疫性轮枝菌的 DNA条形码筛查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 28084棉花黄萎病菌检疫检测与鉴定SN/T 1145首黄萎病检疫鉴定方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1DNA 条形码DNA barcode生物体内能够代表该物种的,标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。3.2内部转录间隔区序列internal transcribed spacer; ITS在真核生物中，核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成,其基因组序列从 5到 3依次为：外部转录间隔区、18 S基因、内部转录间隔区1（ITS1）、5.8 S基因、内部转录间隔区 2（ITS2）、28 S基因和基因间隔序列。内转录间隔区是存在于 18 S rDNA、5.8 S rDNA 和 28 S rDNA 之间的区域，ITS1和ITS2作为非编码区，受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点，在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，能够提供详尽的系统学分析所需的可遗传性状。4检疫性轮枝菌基本信息学名:Verticillium dahliae Kleb中文名：棉花黄萎病菌学名:Verticillium albo-atrum Reinke et Berthold中文名：首黄萎病菌分类地位：真菌界（Fungi），丝孢纲（Hyphomycetes），丝孢目（Hyphomycetales），淡色孢科（Monili-aceae），轮枝孢属（Verticillium）寄主范围参见附录 A。5　方法原理使用 ITS片段作为棉花黄萎病菌和首黄萎病菌的 DNA 条形码基因,通过对检测对象的DNA 进 SN/T 4877.72017行PCR扩增及产物测序后，利用DNA条形码数据库生物条形码数据（BOLD)或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库比对，根据序列相似度筛查物种。6仪器设备和试剂6.1仪器设备超净工作台、高压灭菌锅、4℃冰箱、PCR扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、琼脂糖电泳仪、凝胶成像系统。6.2试剂CTAB提取液、三氯甲烷、乙醇、PCR Taq DNA 聚合酶、PCR Taq 缓冲液、dNTP、DNA 标记物、无菌超纯水。7筛查鉴定方法7.1DNA提取与纯化对真菌进行液体培养或平板培养，CTAB法对基因组DNA 的提取方法详见附录B，测定DNA浓度及纯度后，保存于一20℃冰箱备用。7.2DNA条形码片段PCR扩增利用通用引物进行ITS片段序列扩增（具体步骤参见附录C），测序。7.3序列分析测序结果利用BioEdit等生物信息学软件进行剪接编辑，比对峰图和正反向测序结果是否有误，去掉两端引物部分序列，然后在BOLD数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中比对分析。8 结果判定ITS序列长度500bp左右，在生物条形码数据库BOLD和中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对,若与 DNA条码数据库中检疫性轮枝菌序列相似度大于 99%时，即可以筛查判定是该物种。棉花黄萎病菌和首猎黄萎病菌 DNA条形码参考序列参