SN_T 5124-2019猪Delta冠状病毒检疫技术规范.pdf

ICS 65. 020. 30B 41SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5124—2019猪Delta冠状病毒检疫技术规范Quarantine protocol for porcine deltacoronavirus2019-09-03 发布2020-03-01实施京中国海南出版社有限公司HG944440005449中华人民共和国海关总署发布微活网址：W刮开涂层‘激活密码 SN/T 5124--2019前 言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国天津海关、中国检验检疫科学研究院、浙江大学、中华人民共和国昆明海关、中华人民共和国上海海关。本标准主要起草人：帅江冰、何永强、陈小金、莫虹斐、曾若雪、张晓峰、李肖梁、董志珍、张永宁、张舟、花群义、张强、李健。1 SN/T 5124—2019猪 Delta 冠状病毒检疫技术规范1范围本标准规定了猪 Delta 冠状病毒分离、RT-PCR 和荧光 RT-PCR 诊断技术。本标准适用于猪 Delta 冠状病毒感染的临床诊断和实验室检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct 值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。dNTPs:脱氧核糖核苷酸。LLC-PK 细胞:猪肾小管上皮细胞。PDCoV:porcine deltacoronavirus,猪 Delta 冠状病毒。RT-PCR:逆转录-聚合酶链反应。4仪器设备4. 1CO²培养箱。4.2倒置显微镜。4.3 PCR仪。4.4荧光定量 PCR仪。4.5台式冷冻离心机。4.6生物安全柜。4.7分析天平。4.8微量可调移液器(10uL、100μL、1000 uL)及配套带滤芯吸头等。5试剂和材料5.1本标准所用水应符合GB/T 6682中三级水的规格。5.2 DMEM/F12 培养基。5.3 三氯甲烷。5. 4Trizol5.5逆转录酶。1 SN/T 5124—20195.6 DNA 聚合酶。5.7 RNA 酶抑制剂。5.8RT-PCR用引物,序列如下：上游弓|物:5’-ATCCTCCAAGGAGGCTATGC-3’；下游引物:5’-GCGAATTCTGGATCGTTGTT-3’。5.9荧光RT-PCR用引物和探针,序列如下：上游引物:5’-CGACCACATGGCTCCAATTC-3’;下游弓|物：5”-CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT-3’；探针:5’-FAM-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGC-TAMRA-3’。6概述PDCoV为单股正链、含囊膜的 RNA病毒,基因组约为 25 kb,包含 5'和 3’非编码区及7个开放性阅读框，分别编码多聚酶蛋白（polymerase protein）la/1b、纤突（spike，S）蛋白、小膜（envelope，E）蛋白、膜(membrane，M)蛋白、非结构蛋白 6(nonstructural protein 6,NS6）、核衣壳（nucleocapsid,N)蛋白及非结构蛋白 7(nonstructural protein 7,NS7)。PDCoV引发的疾病以呕吐、水样腹泻、脱水和食欲下降为基本特征，各年龄段猪群均易感，新生仔猪感染率和发病率较高，感染后死亡率为30%～40%。病理学特征主要表现为小肠扩张，肠壁变薄、透明，内充满黄色液体，肠系膜充血，肠系膜淋巴结水肿，小肠绒毛缩短。组织病理学变化可见十二指肠、空肠、回肠绒毛严重萎缩甚至脱落，上皮细胞坏死或空泡化。7 实验室诊断7. 1 病毒分离7.1.1样品处理粪便或肠内容物用含10000IU/mL青霉素、10000 μg/mL链霉素和25μg/mL两性霉素B的0.01 mol/LPBS(见附录A)1：10稀释(w/v），充分振荡混匀，12000 r/min离心20 min,取上清液以0.22 μm 过滤器过滤除菌。十二指肠、空肠、回肠等组织样品刮取肠绒毛放人含三抗的0.01 mol/L PBS(pH 7.2)中,冻融3次后，12000r/min离心20 min,取上清液以0.22 um过滤器过滤除菌。7. 1.2 病毒的细胞分离将长势良好的LLC-PK细胞分装，加人含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃、5%CO² 培养。细胞生长至80%融合度时，弃去旧培养基，以不含血清的DMEM/F12清洗2遍。加人1mL过滤除菌后的样品上清液，同时加人含10000IU/mL