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细胞工程;;细胞工程(cell engineering):通过细胞融合或拆合、核质交换或核移植、染色体或基因转移以及经由细胞培养和筛选,按照人们预先的设计,产生出新的细胞,用于生产、医疗或研发。 ;细胞工程概述;细胞工程概述;一、大规模细胞培养 ;一、大规模细胞培养 ;悬浮培养(suspension culture):是指细胞在培养液中
呈悬浮状态的生长和增殖的培养方法。
适用范围:
血液及淋巴组织细胞;
无需贴壁生长的细胞系、肿瘤细胞;
骨髓瘤及杂交瘤细胞。;用途:
大量生产疫苗;
细胞因子;
某些特殊细胞的基因工程产物。;优点:
设备简单;
容积可选择性大;
成本低;
可连续收集细胞或其产物;
传代时无需消化;
细胞浓度均一,可调控;
细胞产量较恒定。;技术关键:不断震荡培养液以及连续进行气体交换。;2. 固定化培养
固定化培养:使细胞限制或定位于特定空间位
置的培养技术。
适用范围:所有动物细胞。;2. 固定化培养
系统:
吸附法:让细胞在适当的条件下贴附在载体表面、
中空纤维膜或培养容器表面。
包埋法:将细胞包埋于多聚物等海绵状基质中。
优点:细胞以较高密度在较小体积的培养液中生长,
培养液易于更换及分析。;填充式Nunc细胞工厂 ;中空纤维灌流;3. 微载体培养
微载体培养:让细胞吸附于微载体(microcarriers)表面进行生长与增殖的技术,也称微珠培养。
材料选择条件:对细胞没有毒性,能够承受高压灭菌,可重复利用。 ;3. 微载体培养
材料种类:交联葡聚糖、塑料基质、聚苯乙烯、明胶、玻璃介质、胶原或胶原涂层、纤维素、生物玻璃等。;4. 三维细胞培养 ;4. 三维细胞培养 ;二、细胞融合 ;二、细胞融合 ;3.杂交细胞的筛选方法
抗药性筛选:
常用HAT培养基 。;3.杂交细胞的筛选方法 ;4.细胞融合技术应用
细胞基础研究、细胞工程的重要工具,
如生产单克隆抗体。;三、细胞核移植 ;三、细胞核移植 ;克隆羊的产生过程;3.体细胞核移植的应用
细胞工程领域:同种、异种间的动物克隆。
同源克隆(homologous cloning)??将一个体的体细胞核植入同一个体的去核的卵母细胞中,将所获得的干细胞植入供核供体体内。;3.体细胞核移植的应用
细胞治疗价值:
治疗性克隆:从内细胞团取得细胞,扩增及定向诱导 分化后用于治疗某些特殊的疾病。
生殖性克隆:体细胞核移植后,任其发育直至产生一个新个体。 ;四、基因转移 ;2.转基因技术的步骤
外源目的基因的选择与获取;
将外源目的基因导入受体细胞;
对整合有目的基因的细胞进行筛选、扩增及鉴定;
若受体为卵细胞,则进行体外培育,并植入合适的动物子宫内;
筛选并获得转基因动物。;2.转基因技术的步骤;3.转基因的方法
物理法:
电穿孔法、显微注射法、裸DNA直接注射法等。
化学法:
磷酸钙共沉淀法、脂质体包埋法、 DEAE-葡聚糖法等。
生物法:
病毒介导法、体细胞核移植法、精子载体法、胚胎干细胞转染法等。 ;3.转基因的方法
⑴ 磷酸钙介导的DNA转染
原理及基本过程:将氯化钙与外源DNA混合,加入到含磷酸根离子的溶液中,形成钙-磷酸-DNA共沉淀物,该沉淀物被培养的细胞摄取,DNA整合入细胞基因组中最终得到表达。
优点:操作简单,无需昂贵的设备。;3.转基因的方法
⑵ 脂质体介导的转染
原理及基本过程:以一种多价阳离子脂质体作为载体,DNA可被脂质体包被形成复合物,该复合物可与培养细胞的细胞膜融合,DNA进入细胞,整合至受体细胞的基因组中并得以表达。
优点:转染成功率高、适应性广,细胞毒性较低。
缺点:比较昂贵,不利于大规模使用。;3.转基因的方法
⑶ 电穿孔法
原理及基本过程:高浓度细胞悬液短暂地暴露于高电压时,DNA可通过高电压在细胞膜上所形成的小孔进入细胞,然后整合入细胞的基因组并得到表达。;3.转基因的方法
⑶ 电穿孔法
适用范围:
对化学法转移不敏感的细胞;
悬浮细胞更适合。
缺点:
所需细胞及DNA数量多;
不同细胞间的最佳转染参数差异较大,需进行实验条件摸索。;3.转基因的方法
⑷ 病毒转染法
原理:通过病毒感染的途径将外源目的基因
导入受体细胞。;3.转基因的方法
⑷ 病毒转染法
常用方法:
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