GA_T 1160-2014毒品原植物的DNA提取 二氧化硅法.pdf

ICS 13.310GAA 92中华人民共和国公共安全行业标准GA/T 1160—2014常见毒品原植物的DNA提取二氧化硅法DNA extraction from drug plants-Silica method2014-05-09 发布2014-05-09实施中华人民共和国公安部发布 中华人民共和国公共安全行业标准常见毒品原植物的DNA提取二氧化硅法GA/T 1160--2014*中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）网址 总编室：（010行中心：（010者服务部：（010国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销*开本 880×1230 1/16印张 0.5字数 10千字2014年7月第一版2014年7月第一次印刷*书号：155066·2-27209如有印装差错告由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话：（010 GA/T 1160—2014前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国刑事技术标准化技术委员会（SAC/TC179)提出并归口。本标准起草单位：公安部物证鉴定中心。本标准主要起草人：裴黎、涂政、彭建雄、季安全、董林芳、徐小玉、张颖、冯涛、郭佳、张贵芹等， GA/T 1160—2014常见毒品原植物的DNA提取二氧化硅法1范围本标准规定了在法庭科学鉴定中采用二氧化硅法从毒品原植物（大麻、罂粟）中提取脱氧核糖核酸(DNA)的方法。提取。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682一2008　分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1二氧化硅法silica method一种以二氧化硅为固相吸附剂的基因组 DNA提取方法。4原理十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS)是一种离子型表面活性剂，同时也是蛋白变性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚。SDS 和蛋白酶K(PK)共同作用促使蛋白变性、降解，达到裂(GuSCN)存在的条件下,核酸能够与二氧化硅特异性的结合,在较高温度下核酸又能被高 pH 值、低盐浓度溶液从二氧化硅上洗脱下来的特性,获得高质量的植物DNA。5器材5.1眼科剪。5.2眼科镊。5.3旋涡振荡器。5.4高速离心机（离心力≥13000g）。5.5 离心管。5.6移液器。5.7研钵、研杵等组织研磨器具。1 GA/T 1160—20145.8水浴箱、金属加热块等恒温装置。6 试剂6.1裂解液:TNE缓冲液中加人SDS至终浓度0.5%～2.0%(W/V)，pH值为8.0。1%(V/V)Triton-X100溶液，pH值为6.5。本方法中pH值范围为4.0pH7.0,使用的 EDTA若为二钠盐或四钠盐应按分子量再行计算，除使用异硫氰酸胍（GuSCN)外也可使用盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠等其他离液盐,离液盐的终浓度应在 3 mol/L～8 mol/L之间。6.4洗液 1:称取 1.46 g NaCl 和 6.06 g Tris 溶于水中,并用 1 mol/L HCl 和 1 mol/L NaOH调节 pH值为6.4,再加人 591g 的 GuSCN溶于溶液中，最终用水定容至1000 mL。溶液组分的终浓度为 5mol/LGuSCN,25 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris-HCl,pH 值为 6.4。8.0，最终用水定容至1000mL。此溶液和无水乙醇按体积比配制为50%～80%（V/V)乙醇从而制成洗液2,本方法推荐的乙醇浓度为80%。6.6TE缓冲液:将 1.21 gTris 和 0.29 gEDTA溶于水中,使用 1 mol/L HCl和 1 mol/L NaOH 调节pH值为8.0～8.5,用水定容至1 000 mL。6.7 RNase A.6.8聚乙烯吡咯烷酮。6.9 蛋白酶K。6.10 二硫苏糖醇(DTT)。除非另有规定，本方法使用分析纯及以上级别试剂，所用水为GB/T6682一2008规定的一级水。7 操作步骤7.1 预先在研钵中加人约20 mg聚乙烯吡咯烷酮,取植物样本放人研钵,研磨成粉末。取 20 mg～100 mg转移至离心管中。若样本为新鲜叶片或不易研磨的植物组织，可加人液氮和石英砂进行研磨。对于大麻脂等含脂类高的样本，应先用无水乙醚进行脱脂15 min后再行研磨。7.2向离心管中加人 65℃预热的裂解液 300