DB37_T 2843-2016鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法.pdf

ICS 11. 220B 41DB37山 東东省地方标准DB37/T2843—2016鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法Detection method on Duck Tembusu Virus by a double antibody sandwich ELISA2016-09-18发布2016-10-18实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 2843—2016前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：刁有祥、陈浩、唐耀、提金风、冯强、欧全宾，I DB37/T坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法1范围本标准规定了鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA方法的样品采集和保存、样品处理、试剂及仪器、检测步骤、结果判定等。本标准所规定的鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA方法适用于检测鸭组织、分泌物、排溃物和鸭胚尿囊液中的坦布苏病毒，也适用于鹅和其他动物坦布苏病毒的检测。2试剂及仪器2.1试剂2. 1. 1捕获单抗，抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体。2. 1. 2检测单抗，辣根过氧化物酵标记（HRP）的另一株抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体，筒称酶标单抗.2. 1. 3阳性对照：坦布苏病毒鸭胚尿囊液。2. 1. 4阴性对照：SPF鸭胚尿囊液。2. 1. 5磷酸盐缓冲液（PBS），见A.1。2. 1. 6包被液，见A.2.2. 1. 7洗涤液，见A.3.2.1. 8样品稀释液、封闭液，见A.4.2. 1. 9底物溶液，商品化TMB底物显色液。2. 1. 10终止液，见A.5。2. 1. 11甘油盐水，见A.6。2.2仪器2. 2. 1酶标仪。2. 2. 2微量加样器。2. 2. 3恒温塔养箱。2. 2. 4聚苯乙烯板。2. 2. 5水平振荡器。2. 2. 6生物安全柜。3样品准备3. 1样品的采集和处理3.1.1样品的采集死亡鸭采集卵泡膜、脾和脑等组织样品，进行分别处理或同时处理：活鸭采集咽喉或滑殖腔拭子。 DB37/T 2843—20163.1.2样品的保存（%%）0抗生素的选择视当地情况而定，组织和咽喉拭子悬液中应含有青霉素(2000IU/mL)）、链毒素(2mg/mL)、庆大霉素(50μg/mL)和制霉菌素(1000IU/mL)，加入抗生素后pH值应调至7.0～7.4。在室温放置1h～2h内样品应尽快处理。不能尽快处理的可在4存放24h，也可于低温条件下保存（-70C忙存最好）。3.1.3样品的处理样品的处理在生物安全柜中进行。喉头或泄殖腔拭子，置于200μL含有抗生素的pH值7.0～7.4等渗磷酸盐缓冲液中；对组织样品取0.2g置于500μL含有抗生素的pH值7.07.4等渗磷酸盐缓冲液中研磨，反复冻融3次：8000r/min离心5min，取上清作为检测材料。4操作步骤4. 1试验试剂预温到20℃C～25℃。4. 2将捕获单抗用包被液稀释成2.5ng/μL，每孔100μL加入96孔聚苯乙烯板中，4℃孵有过夜。4. 3用洗涤液100μL洗3次，每次置于水平振荡器300r/min震荡3min，甩干板上残余液体。4. 4每孔加入200μL封闭液，恒温培养箱37℃孵育1h，用4.3方法洗板。4. 5在A1、A2孔各加100μL阴性对照，A3、A4孔各加100μL阳性对照。4. 6将待检样品加入其他各孔，每孔100μL，恒温墙养箱37℃孵有1h，用4.3方法洗板。4. 7将酶标单抗用样品稀释液按1:1000倍稀释，每孔加100叫L，37℃有1h，用4.2方法洗板。4. 8每孔加100μL底物溶液，37C避光孵育15min。4. 9每孔加入50μL终止液，轻轻振荡，终止反应，4.10置酵标仪于450nm测定各孔吸光度（0D）值，该操作需30min内完成。5结果判定5.1阴性对照OD均值等于（A1孔OD值+A2孔OD值）/2：阳性对照OD均值等于（A3孔OD值+A4孔OD值）/2.5.2[阳性对照平均值减去阴性对照平均值，其差须大于0.4：阴性对照平均值须小于等于0.20。试验条件成立，否则重做。5.3判定：5.3.1阳性样品液0D450nm≥0.40，判断为阳性，即待检样品中含有坦布苏病毒。5.3.2阴性样品液0D450nm≤0.20，判断为阴性，即待检样品中不含有坦布苏病毒。5.3.3样品样品液0.200D450nl0.40，判断为可，需要重做。2 DB37/T 2843—2016附录A（规范性附录）试剂配制A. 1磺酸盐缓冲液(PBS，0.01mo1/LpH7.4) NaC1308KC10. 2gKH,PO0. 2gNa;HP0,-12H;00. 2g蒸馏水加至1000 nL