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细胞分离技术生物分离过程的一般流程本章内容本章的主要内容常见的细胞壁结构细胞破碎技术包涵体的纯化方法第一节 细胞分离一、过滤二、离心沉降第二节 细胞破碎微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢产物，以及细菌产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶、淀粉酶等等，称为胞外产物。但有些目的产物存在于细胞内部，如大多数的酶、蛋白、类脂等，称为胞内产物。自80年代以来，基因工程广泛应用，许多具有重要价值的生物产品应运而生，如胰岛素、白细胞介素、干扰素等。许多基因工程产物都是胞内产物，分离提取这些产物时，首先必须将细胞破碎，使产物释放，才能进一步提取分离。因此，破碎技术已引起了基因工程专家和生化工程专家的极大关注。概 述细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。※细胞壁结构对破碎的影响微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。 一、细胞壁的结构1、细菌细胞壁结构几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖组成，它是难溶性的聚糖链；相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包围在细胞周围；使细胞具有一定的形状和强度。细菌细胞壁结构破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。 革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。药物名称宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素大肠杆菌治疗侏儒病α-干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病等 2、酵母细胞壁最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯键连接成网状。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物。破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。3、真菌的细胞壁真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。红面包霉菌细胞壁具有同心圆层状结构主要存在三种聚合物最外层(a)是α-和β-葡聚糖的混合物，第2层(b)是糖蛋白的网状结构第3层(c)主要是蛋白质，最内层(d)主要是几丁质。红面包霉菌细胞壁的结构示意图细胞壁的组成和结构细胞壁的组成和结构微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌真菌壁厚20-80 nm10-13 nm100-300nm100-250nm层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)肽聚糖 (5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白质(6-8%)脂类(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂类蛋白质微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌霉菌壁厚20-80 nm10-13 nm100-300nm100-250nm层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)肽聚糖 (5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白质(6-8%)脂类(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂类蛋白质三、 细胞破碎技术细胞破碎方法及其原理捣碎法研磨法匀浆法超声法 通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。机械破碎通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。温度差破碎法压力差破碎法物理破碎有机溶剂：表面活性剂：酸碱通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎化学破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎自溶法外加酶制剂法酶促破碎一、机械法机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法（homogenization）高速珠研磨破碎法（bead grinding）超声波破碎法（ultrasonication）1.高压匀浆法（High-pressure homogenization）采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每