DB23-T1235-2008马铃薯环腐病检测方法.pdf

1CS67.060goyDB23备案号：電方标准黑龙·江省地马铃薯环腐病检测方法-X又发布2002X实施200黑龙江省质量技术监督局发布 DB23/T ××××-<XXX前言本标准在制定过程中，经过调查研究、参考有关资料和分析实验结果，规定了马铃薯环腐病田间检测方法和三种室内检测方法。本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由黑龙江省农业委员会提出。本标准由黑龙江省农业标准化技术委员会归口。测试中心（哈尔滨））。本标准主要起草人：王晓丹、郭梅、胡林双、闵凡祥、魏琪、董学志、马纪、李学湛。本标推系首次发布。 DB23/T ××××图6马铃薯环腐病菌DAS-ELISA检测结果示例 DB23/T ×××x马铃薯环腐病检测方法1 范围本标准规定了马铃薯环腐病检测方法。本标准适用于马饸薯植株和块茎的环腐病田间和室内检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB6682分析实验室用水规格和试验方法GB7331-2003马铃薯种薯产地检疫规程GB8855新鲜水果和蔬菜的取样方法3检测方法3.1田间检测方法3.1.1原理马铃薯环腐病菌引起的主要症状特征是本检测方法的依据。3.1.2田间检测抽样执样标准按照GB7331-2003中5.1.1.2规定的调查方法执行。3.1.3马铃薯环腐病田间症状脉鼎绿色，叶肉为黄绿或灰绿色，具明显斑驳，且叶尖于枯或向内纵卷，病情严重时向上扩展，致全株枯死；萎型初期则从顶端复叶开始萎，叶缘稍内卷，似缺水状，病情严重时向下扩展，全株叶片开始褪绿，内卷下垂，终致植株倒伏枯死。当横切植株茎基部时，可见维管束呈浅黄色或黄褐色，有乳状物溢出。3.1.3.2块茎：感病块茎维管束软化，呈淡黄色，切开后可见维管束变为乳黄色至黑褐色，皮层内出现环形或弧形坏死部分。发病严重的块茎挤压时，维管束部分与薯肉分离，组织崩溃呈颗粒状，并有乳黄色菌浓溢出。经贮藏，块芽眼变黑干枯或外表爆裂，播种后不出芽或出芽后枯死或形成病株。3.1.4检测结果根据马铃薯植株或块蒸上的症状，目测判定马铃薯环腐病，并计数，确定样点内病株/病薯率。3.2室内检测方法样品的取样方法按照GB8855中规定的取样一般要求执行，室内检测所用的水按照GB6682中规定的三级水要求执行。本标准提供了三种室内检测方法，可根据实际情况任选其中之一3.2.1革兰氏染色3.2.1.1原理马铃环腐菌（Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus Davis et al.）为革兰氏阳性菌，革兰氏染色后镜检，菌体呈蓝紫色。将革兰氏染色涂片在显微镜10×100倍及油镜下观察，菌体为棒杆状，通常长为0.8μ㎡～1.2m，宽为0.4μm～0.6μm，单个存在，偶尔成双，间或出现“”、“L”“Y”形连接，以此判断马铃薯环腐病菌。 DB23/T ××xxXXXX3. 2. 1. 2 试剂结晶紫（又称龙胆紫）染色液，碳酸氢钠，碘，氢氧化钠，丙酮，95%乙醇，碱性品红，70%酒精溶液，香柏油，二甲苯。3.2.1.3操作步骤3. 2. 1. 3. 1试剂配制见附录A3.2.1.3.2试样制备见附录 A3.2. 1.3.3测定步骤染色：滴1滴结晶紫染色液与碳酸氢钠溶液等量混合（现用现配）于载玻片上，染色20s。一媒染：滴1滴碘媒染液于上述玻片上媒染20s，滴水洗涤。一脱色：脱色剂脱色5～10s，滴水洗涤。一复染：滴1滴碱性品红复染液复染2～3s，滴水洗涤，风干。一镜检：用显徽镜在10×40倍和10×100倍下镜检复染后的涂片，并以经革兰氏染色的标准阳性环腐病菌为对照。3.2.1.4结果判定镜下的菌体颜色若为蓝紫色，加1滴香柏油于10×100倍下镜检，观察菌体形态，与标准菌株形态致的则为革兰氏阳性菌，判定是马铃薯环腐病菌，形态不一致的判定不是马铃薯环腐病菌；菌体若为粉红色，则为革兰氏阴性菌，判定不是马铃薯环腐病菌。3.2.2双抗体夹心酶联免疫吸附测定法（DAS-ELISA)3.2.2.1原理见附录B3.2.2.2仪器设备酶标仪、微量移液器、恒温振荡培养箱、不同规格的量筒、烧杯、容量瓶等。3.2.2.3操作过程-将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。一加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。一加底物显色。固相上的