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电子显微镜技术第一节 电镜的基本理论和分类第二节 透射电子显微镜第三节 扫描电子显微镜第四节 电镜样本的取材 55年之后， 1986年获诺贝尔物理学奖鲁斯卡(左)和他发明的第一台电镜（1932年）二十世纪最主要的发明之一第一节 电子显微镜的基本理论和分类 电子显微镜镜以电子射线作为照明源，以电磁场作为透镜，具有高分辨率和放大倍率的显微镜。电镜用于研究组织和细胞的超微结构。电子束（electron beam）又称电子射线电子束带负电荷具有光的波动性可折射性电镜利用电子束作为“光源”成像电子枪电子束电子与样品作用后产生的电子信号主要有：二次电子透射电子和二次电子样本样本透射电子透射电子（transmission electron） 当样品厚度小于100nm时，部分电子可穿透样品，将穿透样品的电子叫做透射电子，利用透射电子信息成像的称为透射电镜。二次电子（Second electron） 在入射电子的轰击下，样品表面5～50nm深度激发出来的电子称为二次电子，利用二次电子信息成像的称为扫描电镜。透射电子显微镜（TEM） Transmission electron microscopy扫描电子显微镜（SEM） Scanning electron microscopy其他类型:根据电压分为: 低、中、高压电镜根据用途分为: 分析电镜、环境电镜电镜的基本类型透射电子显微镜－TEM transmission electron microscopy 扫描电子显微镜－ SEM Scanning electron microscopy放大倍率：150万倍分辨率：0.1nm放大倍率：80万倍分辨率：0.6nm分辨率（resolution） 表示人眼和光学仪器能够辨别两点之间最小距离的标志。 两点间的距离越小，表示： 分辨率 ？ 仪器所能分清被观察物体的细节 ？分辨率是衡量电镜性能的重要指标人眼分辨率光镜分辨率电镜分辨率0.2毫米（mm）0.2微米（μm）0.2毫微米（nm）分辨率（resolution） 显微镜的分辨率与波长的关系？（半波长） 光波波长约 0.4 μm，光镜的分辨率？ 电子波长约 0.005 nm，电镜的分辨率？3.000×50×TEM：1000倍～100万倍SEM：5倍～80万倍 放大倍率 ＝人眼分辨率÷显微镜分辨率（magnification） TEMSEM0.1nm 150万倍透射电子信号成像超薄切片等，过程复杂二维结构，平面图像组织细胞内部超微结构0.6nm 80万倍二次电子信号成像较简单，标本可大而厚三维结构图像，立体感强表面及其断面立体形貌分辨率放 大成 像样品制备图像特点应 用第二节 透射电子显微镜（TEM）Transmission Electron Microscopy一、透射电子显微镜结构和工作原理二、透射电子显微镜的样本制备技术三、透射电子显微镜在医学领域的应用 一、TEM结构和工作原理辅助系统镜筒真空系统：机械泵、油扩散泵、真空管道、阀门等照明系统：电子枪、聚光镜成像系统： 样品室、物镜、 中间镜、投影镜电源系统：高压电源等 观察记录系统：观察室、底片室 水冷系统：循环水泵等电子枪电子束聚光镜物镜样品光栏投影镜荧光屏 电子束投射在样品上，部分电子直接穿透样品产生透射电子 带有样品信息的透射电子经成像系统放大，投射到荧光屏上 透射电子多，荧光屏亮；反之荧光屏暗，荧光屏的亮暗程度与样品微细结构一一对应，产生具有一定反差的黑白影像TEM成像和工作原理二、TEM 的样品制备技术超薄切片技术 Ultramicrotomy2. 负染色技术 Negative staining technique 3.免疫电镜技术 Immune Electron Microscopy（IEM）1. 超薄切片（ultrathin section ）制备技术超薄切片制备技术基本操作程序取 材 预固定 后固定 脱 水 浸 透 包埋聚合 修 块 切 片 染 色蜡片快在1分钟内固定！小1mm3的小块轻不要牵拉、锯、挤压组织冷低温操作，4℃保存取 材 为什么？ 1分钟内固定，尽可能保持其生活状态，因为瞬间的拖延都会导致细胞超微结构的变化。 约1mm3的小块，组织块过大其中央得不到及时固定会发生细胞自溶现象。 不要牵拉、锯、挤压组织，避免细胞受到损伤。 低温操作，4℃保存，降低酶的活性，避免组织发生自溶。快 小 轻 冷 温度越低越好吗？－20℃冷冻后快小组织未及时固定轻牵拉损伤后轻血管内皮预固定组织块浸泡固定体内原位固定血管灌注固定常用预固定剂：2 .5% 戊二醛 取2～3块组织迅速浸泡于固定液中如：肝、脾、肺如：胃、肠、皮肤组织块浸泡固定 1mm3