DB37_T 1826-2011猪圆环病毒2型环介导等温扩增技术.pdf

ICS 65.020. 30B 43DB37山 長东省地方标准DB37/圆环病毒2型环介导等温扩增技术Loop-mediated isothermal amplification for porcine circovirus type 22011-04-08发布2011-06-01实施山东省质量技术监督局发布 DB37/ T XXXX—XXXX前言本标准的编制依据GB/T1.1-2009的规定。本标准由山东省农业科学院提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所：青岛农业大学。本标准主要起草人：王金宝、李俊、吴家强、韩德、时建立、周顺、丛晓热、徐绍建、孙文博、杜以军。I DB37/ T XXXX—XXXX猪圆环病毒2型环介导等温扩增技术1范围本标准规定了猪圆环病毒2型（PCV2）的环介导等温扩增（LAMP）检测技术的要求，本标准适用于猪血清和组织中猪圆环病毒2型的检测。2材料2. 1器材2. 1. 1微量移液器（最大量程为10μL、20μl、100μL、1000μL）2. 1. 220000g低温离心机2. 1. 3电热恒温水槽2. 1. 4稳流稳压电泳仪2. 1. 5水平电泳槽2. 1. 6凝胶成像系统2. 2紫外透射反射分析仪试剂2. 2. 1蛋白酶K溶液（20mg/mlL）：配制见附录A.1章2. 2. 210%十二烷基硫酸钠（SDS溶液，pH7.2）：配制见附录A.2章2. 2. 3Tris平衡酚2. 2. 4三氯甲烷2. 2. 5无水乙醇2. 2. 670%乙醇：配制见附录A.3章。2. 2. 75mol/LBetaine溶液：配制见附录A.4章2. 2. 8100mmo1/LMgS04溶液：配制见附录A.5章2. 2. 9Bst DNA Polymerase (8U/μL)2. 2. 10SYBR GreenI核酸染料2. 2. 110.5×TBE缓冲液：百配制见附录A.6章，2. 2. 12电泳级1%琼脂糖：百配制见附录A.7章，2. 2. 1310mg/nl的溴化乙锭（EB）水溶液。2. 2. 14DNA Marker 20002. 3引物F3:5′CTCCAGTGCTGTTATTCTAGATGA3'B3:5′TTTCCAGCAGTTTGTAGTCTCA3"FIP:5*GAAGGGCTGGGTTATGGTATGGCTTTTACAGCCCTCACCTATGACC3*BIP:5′CCGCTACTTTACCCCCAAACCTTTTTGCCACAGCTGATTTCTTTTGTTG3"1 DB37/ T XXXX—XXXX3方法3. 1病料处理将病料剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐水1：5倍稀释，取悬甚液反复冻融3次，5000g离心15min，取上清液-20℃保存备用。3. 2病毒DNA的提取3. 2. 1取上清液（或血清）500μL加入10%SDS溶液50μL、20mg/mL蛋白酶K溶液10μL，于55℃水浴23h.3. 2. 2加入200μlTris饱和酚，充分混匀，10000g离心15min3. 2. 3取上清液，加入200μLTris饱和酚和200μL三氯甲烷，10000g离心15min。3. 2. 4取上清液，加入200μL三氯甲烷，10000g离心15min。3. 2. 5取上清液，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃C静置20min，10000g 离心 15min3. 2. 6弃上清液，如入70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。3. 2. 7加入20μL灭菌超纯水溶解沉淀，-20℃保存备用3. 3环介导等温扩增(LAMP )详见表1。表1环介导等温扩增反应体系步骤110xThermoPo12. 5 μl步粥2dNTP混合液(10mmo1/L)1. 5μL步3B3/F3 (5μmo1/L)2. 0 μlx2步骤4BIP/FIP (50μmo1/L)1. 0 μLx2步驱5MgS0, (100 mo1/L)1. 0μL步聚Betaine (5no1/L)2. 5 μl步驱7DNA1. 0 μL步8Bst DNA Polymerase (8U/μL)1 μl.步驱8翅纯水9. 5μl.LAMP程序设定每次LAMP均应设一个阴性对照，：具体参数见表2表2LAMP反应程序设定温度时间步162°℃60sin步20.085nin结果分析和判定4. 1电泳摄作4. 1. 11%琼脂糖凝胶板的制备（见附录A.7）2 DB37/ T XXXX—XXXX称取0.6g琼脂糖，加入60mL0.5×TB缓冲液中，加热融化，温度降低后加入1%的EB，倒入电泳槽中.4. 1. 2加样将LAMP扩增产物5μL与1μL6xLoadingBuffer混