DB37_T 4053-2020新城疫病毒基因VII型荧光定量PCR检测方法.pdf

ICS 11. 220B 41DB37山 東东省地電方标准DB37/T4053—2020新城疫病毒基因VII型荧光定量PCR检测方法Real-time PCR assay for the detection of genotype VII newcastle disease virus2020-07-09发布2020-08-09实施山东省市场监督管理局发布 DB37/T 4053—2020前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学家禽研究所。本标准主要起草人：孟凯、吴家强、宋敏训、袁小远、张玉霞、杨金兴、艾武、王友令、元丽红。I DB37/T 4053—2020新城疫病毒基因VII型荧光定量PCR检测方法1范围本标准规定了新城疫病毒基因VII型（NDV）荧光定量PCR检测方法本标准适用于鸡响喉和泄殖腔拭子及脑、肺脏、脾脏等组织中新城疫病毒基因VII型的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3试验原理实时荧光定量PCR检测是在PCR反应体系中，除采用特异的引物外，还加入了与DNA双链非特异性结合的SYBRGreenI荧光染科。当它与DNA双链结合时，发出荧光，从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。随着PCR反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。4试剂或材料除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水为GB/T6682规定的一级水。4.110×磷酸盐缓冲液PBS：pH值7.2。4.2研体。4.3病毒RNA提取试剂盒。4. 4SYBR Green I RT-PCR 缓冲液。4.5酵混合物：内含MLV反转求酵和RNaseInhibitor4.6DNA聚合酶4.7阳性对照：浓度为1.0×10°拷贝/μL的阳性质粒。4.8阴性对照：水。4.9DEPC 水.5仅器设备5.1微量可调移液器：最大量程为10μL、20μL、100μL、1000μL。5.2台式高速冷冻离心机：最高转速16000I/min。5.3荧光定量PCR仪：温度范围4.0℃C~99.9℃5.4分析天平：精度为0.01g. DB37/T 4053—20205.5冰箱：规格为4℃C和-20℃。5. 6二级生物安全柜。6引物Forward Primer: 5 CAYGTCYGGAGGAAGGAGRCARAA3Reverse Primer: 5 GGATGTTGRCRGCATTCTKKT3*注：Y=C或T；R=A或GK=G或7样品7.1采集工具棉拭子，剪刀，镊子，1.5mL离心管。7. 2样品采集7. 2. 1咽喉拭子/泄殖腔拭子7.2.1.1咽喉拭子采样：将棉拭子深入喉头来回刮3次，取咽喉分泌液，放于含抗生素（青霉素2000）（//7. 2. 1. 22泄殖腔拭子采样：将棉拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便（需有可见美便），放于含抗生素（青霉素 10 000 U/ml+链霉素 10 mg/mL）的 PBS 中。7.2.2组织样品待检禽无菌采集脑、肺脏、脾脏等组织，装入一次性采样袋或其他灭菌容器，编号。7. 3样品运输与保存样品放于保温箱中加冰，密封，24h内送至实验室，如不能立即检测，需将样品放于-20℃冰箱保存。7.4样品处理7.4.1咽喉拭子/泄殖腔拭子将装有喉拭子/泄殖腔拭子的1.5mL离心管在振荡器上充分混合后，取出棉拭子，4℃条件下5000r/min离心10min，取上清液转入新的1.5mL离心管中，编号备用。7.4.2组织样品将组织置于灭菌的研钵中，按照质量体积比（1：5～10)加入灭菌PBS进行充分研磨，4C条件下5000r/min离心10min，取上清液转入新的1.5mL离心管中，编号备用。8试验步骤8.1病毒RNA提取2 DB37/T 4053—2020提取RNA时应避免RNA酶污染。同时设立阳性对照和阴性对照。用病毒RNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取待检样品RNA，-80C保存备用8. 2荧光定量PCR反应体系详见表1。表1荧光定量PCR反应体系试剂使用量酶混合物0. 4 μ 1.DNA聚合酶0. 4 μ 1.SYBR Green I RTPCR Buffer*10 μ LPCR Forvard Priner (10 μ nol/L)0. 4 μ 1.PCR Reverse Priner (10 μ nol/L)0. 4 μLTotal RNA2. 0 μ