DB23_T 1233-2008马铃薯品种PCR鉴定方法.pdf

ICS 67.060B 23DB23黑龙江省地開方标准DB23/T 1233-2008马铃薯品种PCR鉴定方法2008-03- 10 发布2008-04-10实施黑龙江省质量技术监督局发布 DB23/T ××××—×××x前言本标准附录A为规范性附录。本标准由黑龙江省农业委员会提出。本标雅由黑龙江省农业标推化技术委员会归口。本标准起草单位：黑龙江省农业科学院植物脱毒苗本研究所（农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心（哈尔滨))。本标准主要起草人：」白艳菊、李学湛、于德才、吕典秋、范国权、耿宏伟、高艳铃、王文重、张威、张抒。 DB23/T ×××××××x引言长期以来黑龙江省一直是马铃薯生产重娶省份，也是中国种薯输出的主要省份之一，马铃薯除了具有粮菜兼作的特点，其显著的经济附加值受到更普遍的重视，不同马铃薯品种特性具有不同的生产应用价值，那么，明确了解马铃薯品种的纯度和特性对于其在应用中更好的发挥品种优势具有重要作用。本标准采用DNA指纹分析法进行马铃薯品种鉴定，有效解决马铃薯品种混杂和品种鉴定等问题，对丁马铃薯生产、加工、育种、常规检验、御裁检验、质评价、销售以及种子资源保护等都有非常重要的实际意义。1 DB23/T ×××x-XXXX马铃薯品种PCR鉴定方法1范围本标准规定了利用PCR方法鉴定马铃薯品种。本标准适用于马铃薯品种的鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适朋于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文仆，其最新版本适用丁本标准。GB7331马铃薯种薯产地检疫规程GB18133马铃薯脱毒种薯3仪器a) PCR 仪;b）低温高速离心机(≥12,000g);c）稳压稳流电泳仪、垂直板电泳系统：d）冰箱、超低温冰箱：e）紫外灯或紫外凝胶成像仪；f)微量移液器（0.1~2μL、0.5~10μL、10~100μL、20~200μL、100~1000μL）;g）恒温水浴锅（37℃~95℃）；h）制冰机。4　试剂4.1常规试剂4.1.1TE缓冲液（pH8.0）见附录A.14.1.2样品提取缓冲液见附录A.24. 1. 3324：1氯仿/异戊醇混合液见附录A.34. 1.4异丙醇4.1.570%酒精4.1.6Taq DNA聚合酶（5u/μL），严格按照说明书保存4.1.70.IM DTT4.1.8四甲基乙二胺（CHN（CH2）2NCH）4.1.930%丙烯酰胺贮液见附录A.44. 1. 10过硫酸铵贮液见附录A.54. 1: 1110×TBE缓冲液贮液见附录A.6，使用时将其用蒸馏水稀释成1×TBE使用缓冲液4.1.128%聚丙烯酰胺凝胶见附录A.74.1.13溴化乙锭（EthidiumBromide简称EB）（10μg/uL）见附录A.84.1.14载样缓冲液见附录A.94. 1. 1555mMdNTPs见附录A.101 DB23/T ×xxx.4.1.1610×PCR 缓冲液见附录 A.114. 1. 17 DNA Ladder Marker: 100bp~1500bp4.2引物表1马铃薯品种鉴定引物序列引物序列（5’到3）贮存浓度（μM）SSI-FTCT CTT GAC ACG TGT CAC TGA AAC3SSI-RTCA CCG ATT ACA GTA GGC AAG AGA3Patatin-FCAA CCAACAAGG TAAATG GTA CC.6Patatin-RTGG TCT GGT GCA TTA GAAAAAA6STM0014-FCAG TCT TCA GCC CAT AGG3.6 STM0014-R TAAACAATG GTA GACAAG ACAAA3.6UGP-FGAA ACT GCT GCC GGT GC8UGPM-RCAA TGG GGT TCC ATC AAA C85实验条件5.1i避免样品污染DNA的提取及PCR扩增所使用的微量移液器为分子检测专用，主要耗材（1.5mL、0.5mL离心管，PCR管，与微量移液器配套的枪头）需要灭菌，试剂要防上污染。5.2个人防护和环境保护电泳中的EB可诱发基因突变，操作人员在操作过程中需佩戴手套和口罩，电泳后的凝胶，以及被EB污染的物品要依据EB使用说明进行处理。6操作程序6.1样品的采集和处理检测材料可以是大田马铃薯叶片、休眠块茎、试管苗或芽。田间样品采集按照GB18133和GB73311中要求随机采集叶片，登记编号，利用冰盒携带，4℃条件下保存。块茎和芽样品采集后，4℃条件下保存。试管苗提取前不开封，防上污染。样品在4℃条件下可保存2周，在-20℃条件下可保存6个月，在-70℃条件下可保