RFLP限制性内切酶片段长度多态性.doc

一、基本原理   限制性核酸内切酶（restriction end nuclease）能够识别DNA双链上特异的碱基序列并能 将之切断。不同的限制性核酸内切酶有各自特异的识别序列。在同源染色体相应的DNA区段 ，用一种限制性核酸内切酶消化，由于碱基组成不同，就会产生不同长度的酶切片段，然后 用标记好的相应的DNA探针与这些片段杂交，显示出的图谱就可以反映出基因组DNA碱基序列 组 成是否存在差异。这一技术的基础是通过限制性核酸内切酶切片段长度多态性来揭示DNA碱 基序 列组成的异同，因而称为限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorp hism，缩写为RFLP）技术。它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、 还是由缺失、插入造成的。  　　二、RFLP技术的基本步骤   这一技术主要包括三大步骤： 　　1、靶DNA的准备 先将基因组DNA抽提出来，选用合适的限制性核酸内切酶酶解基因组DNA， 将酶解出来的具有各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳分离，使其按片段的长短排列，将D NA片段变性后转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，称印迹（Southernb1ot）转移，并在80℃烘烤 或用长波紫外线照射，将DNA固定在膜上。 　　2、核酸探针的标记 将准备作为探针的DNA片段纯化（这些DNA片段可以是基因组DNA的 一个片段，或是cDNA，或是人工合成的寡核苷酸），用放射性元素（如α－32p）或非放射 性元素（如Dig－dUTP等）标记，经纯化后再用。探针的获得最先用内切酶处理植物的 DNA获得DNA片段，再将其重组到质粒上，使它能插人细菌寄主细胞并在里面进行复制，通过稀释繁殖，每个菌落一般由携带某一段 DNA的细菌繁殖而来，这种在细菌细胞中扩增、纯化DNA 片段的过程称做DNA克隆,这—系列的克隆经放射性同位素标记就成了一系列的探针。 　　3、杂交显示 将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼龙膜上的单链核酸杂交，洗膜去除未杂交 的标记探针后，进行放射自显影或加入酶的底物进行显色反应，再对显示出来的谱带进行分 析。  　　三、RFLP技术的优点及注意的问题   　1、RFLP技术的优点  　　第一，标记数目可以是无限的：RFLP揭示的是DNA水平自然变异，其数目几乎是无限的。 　　第二，大部分标记为共显性：表现RFLP的位点一般是单一序列，每个位点通常有两个等位基 因(其显性)。遵循孟德尔式遗传，因而RFLP标记图也可用传统的基因标图方法来构建。 　　第三，任何生育期都可预测，不受环境影响：DNA分子水平标记没有发育阶段或器官的特异 性，不受环境条件及基因互作的影响。 　　第四，高度变异性：每一植株都会有大量的多态性。通常只要有一次有性杂交，一个作图群 体就能构建一个较丰富的RFLP图谱。 　　2、在做RFLP分析技术时，有几个问题是需要引起密切注意： 　　第一，作为检测对象的DNA分子必须保持大分子，在抽提DNA的过程中避免人为地将DNA分子 机械性切割成小片段的DNA，否则最终显示的RFLP图谱可能是一种假象； 　　第二，在用限制性内切酶消化大分子DNA时，要使DNA被完全消化，否则所得的结果也不可靠 ； 第三，被消化的DNA浓度不能太高； 第四，电泳时要用低压电泳； 　　第五，杂交前探针必须充分变性； 　　第六，要根据探针标记的情况以及探针与靶DNA间序列互补的程度和G、C的含量来掌握杂交 和洗膜的条件； 　　第七，作放射自显影时，要根据杂交后膜上的放射活性等因素决定曝光的时间。  　　四、RFLP在作物遗传育种上的应用   　1、分子水平上选择目的性状 　　RFLP图本身对植物育种并没有直接的用处，只有当它与经典标记即原已定位的基因结合起来 才有用，当确定哪一个RFLP标记与目的性状表现协同分离，即目的基因与RFLP的连锁，使得 对期望基因重组型的选择容易进行，在分子水平上选择目的性状，不受环境条件遗传背景的 影响，RFLP连锁图谱为育种者们提供了一种高效选择手段，在马铃薯、玉米、辣椒、棉花、 大豆、生菜、甘薯、番茄、麦类作物上已相继出现RFLP作图的有关报道。育种者们只要选择 了与目的基因紧密连锁的一个或多个RFLP标记，也就选择了目的基因，因为与目的基因连锁 的RFLP标记是易于检测的。这种间接对那些直接选择有困难或过于费时、费力的性状以及在 分离群体中隐性性状的选择特别有效。在番茄中已鉴定的与RFLP标记连锁的基因，有番茄花 叶病毒、镰刀菌、细菌斑和根结线虫的抗性基因及控制植株生长习性(SP)和果实成熟特性的 主效基因，另外玉米中矮杆花叶病毒抗性基因、莴苣霜霉