基因工程概论课件.pptxVIP

;;;利用基因工程技术不但能得到大量的具有特殊功能的基因，而且可以让这些特殊功能的基因生产出具有特殊功能的蛋白质药物，这是目前基因工程领域中最活跃最有成果和极富商业价值的领域之一，究其原因： （1）蛋白质和多肽是基因表达的直接产物，可用重组DNA技术进行研究和生产。 （2）具有生物活性的蛋白和多肽是珍稀而具有很高医疗价值的药物，用常规分离的方法很难制取。 人类最早的商业化基因工程药物是人胰岛素和人生长激素，于80年代初投放市场，用大肠杆菌来生产，是基因工程发展的里程碑。;?神经生长因子在大肠杆菌中表达;? PCR扩增NGF成熟肽基因;表达载体pET15b-NGF酶切鉴定 1、8. DNA marker (DL-15000); 2.辅助质粒pLysS的HindⅢ单酶切; 3.辅助质粒pLysS的Bam H?单酶切; 4.质粒pET-15b 的BamH ?单酶切; 5. 表达菌pET-15b-NGF 的BamH ?单酶切; 6. 表达菌pET-15b-NGF 的BamH ?/Nde?双酶切; 7. PCR 产物。 ;;原核系统表达的真核基因蛋白有时缺乏生物活性，因此用真核细胞表达和生产基因工程药物已受到重视。 真核细胞反应器：外源基因在合适的载体带动下转染进入体外培养的哺乳动物细胞，昆虫细胞或酵母细胞，通过大规模培养细胞表达外源基因。 几种重要的基因工程药物已可用真核细胞反应器完成。;长效GLP-1在毕赤酵母中的高效表达;10拷贝GLP-1串联融合基因及其表达载体的构建。 在单拷贝基因改造的基础上，采用PCR技术获得双拷贝串联GLP基因，以双拷贝串联GLP基因载体为基础，再分别插入2、4、8拷贝，最终获得10拷贝rolGLP-1的GLP-M串联融合基因及其表达载体pPIC9KGLP-T，从而实现高效表达(表达量提高10倍)。;十拷贝rolGLP-1串联融合基因构建策略：;GLP-1 超产菌的获得： SacI线性化表达载体，电法转化毕赤酵母感受态细胞GS115，在G418－YPD平板上筛选表重组子。 斑点3-6是为重组子NK10-13号。 用NK11菌株，通过优化发酵条件使GLP-M发酵产率达到0.5g/L。 发酵液浓缩后通过His-Ni层析，即可获得纯净的GLP-M样品。;三、植物基因工程 ;;农杆菌Ti质粒作为植物基因工程载体 ;DNA直接导入技术： ① PEG法 ② 电穿孔法 ③ 超微注射法 ④ 脂质体法 ⑤ 基因枪法 ; 植物基因工程的主要成就;???甘膦在低浓度时非常有效，对人无毒，可被土壤中微生物分解。 从抗草甘膦的细菌中分离和克隆EPSP合成酶基因和抗除草剂基因工程示意图。 首先从抗草甘膦的细菌中分离和克隆EPSP合成酶基因，再进行植物抗除草剂基因工程。;Tobacco leaves expressing the hepatitis B antigen. 转基因植物叶片表达乙肝病毒表面抗原。 叶片用抗乙肝病毒表面抗原的抗体处理的结果。 ;?易于长期保鲜的转基因西红柿制作：; 转基因西红柿的途径。; 3、植物细胞的转化方法 （1） 叶圆片共培养转化 （2） 单细胞水平上的转化 在Kan培养基上选择转化的组织——再生植株。 ?转基因植株的遗传 以孟德尔比例传递。 转基因植株的一对染色体。 ; 四、转基因动物;受精卵 四细胞胚胎 囊胚 原肠胚 转基因动物 显微注射 反转录病毒感染 DNA DNA ;?转基因小鼠的制备方法 1974年，Jaenish和 Mintz应用显微注射法首次成功地获得了转基因小鼠。 Palmiter等人于1982年将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中，获得了转基因的硕鼠。;?DNA显微注射法;●胚胎干细胞法;?利用胚胎干细胞;1、深色鼠交配后得到胚泡期的胚胎； 2、从胚泡期的内细胞团中分离和培养胚胎干细胞； 3、用DNA转染培养的胚胎干细胞； 4、将转染的胚胎干细胞注入浅色鼠交配得到的胚泡中； 5、将上述胚泡移植到浅色母鼠子宫内，得到杂合后代（深浅杂合）； 6、将杂合鼠（深浅杂合）与浅色鼠交配得到后代； 7、对得到的深色鼠后代作DNA鉴定，如果含有外原DNA即为转基因小鼠。;转基因动物的应用 ?研究遗传疾病的基