大肠杆菌实验诊断研究进展详解.pptVIP

循环参数 1．变性温度和时间 模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因,在变性步骤，使温度达到双链DNA完全分离的变性条件是95 ℃ ，30s。对GC含量高的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。在解链温度下，DNA的变性仅需几秒。但是，使反应管内达到解链温度需要一定的时间。原则上变性步骤应高温、短时，即要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。 当前第31页\共有43页\编于星期三\3点 大肠杆菌实验诊断研究进展详解演示文稿 当前第1页\共有43页\编于星期三\3点 （优选）大肠杆菌实验诊断研究进展 当前第2页\共有43页\编于星期三\3点 大肠杆菌O157: H7感染临床表现 出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。 溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%，各别可高达50%。 血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。 当前第3页\共有43页\编于星期三\3点 大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经 大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。 在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。 大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题 我国情况也不容乐观 当前第4页\共有43页\编于星期三\3点 一、细菌培养与鉴定 1．分离培养 早期培养对确定病原有重要意义。 培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。 培养基： 山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂 改良的伊红美兰 、改良的SD-39（MSD）琼脂 添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC） 添加了头孢克肟和鼠李糖（0.5%)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC） “科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基 四溴荧光亚甲基兰琼脂 H7抗血清—山梨醇发酵培养基 当前第5页\共有43页\编于星期三\3点  增菌液： 含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液 含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤 新生霉素MEC肉汤 月桂基胰蛋白胨肉汤 加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性 头孢克肟 0.05mg/L 亚碲酸钾2.5mg/L 新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L 当前第6页\共有43页\编于星期三\3点 2．免疫磁珠分离法 免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。 方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。 当前第7页\共有43页\编于星期三\3点 Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。 Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。 Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。 Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157: H7。在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应(PCR)检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。因此,IMS提高了大肠杆菌O157: H