基因操作原理display基因展示技术.pptxVIP

基因操作原理display基因展示技术;通常是指通过遗传操作 将外源大分子定位表达在微生物细胞表面 以便直接利用全细胞进行后续工作 而无须基因产物的 提取、纯化、和重新折叠等操作;MCSD主要以构建融合蛋白方式来实现;宿主菌 细菌和酵母菌;第5页/共102页;二、微生物细胞表面展示技术的应用 MCSD技术广泛应用于生物工程领域，可开发和利用来进行蛋白构象的分析、活菌疫苗的研制、临床诊断、表面抗原的直接克隆、以及抗体工程应用等。;三、举例;Schematic Presentation of E. coli OmpC ;GATAGATACCTGCAGGTCGACCCAAGCGGACATCACCATCATCACCATTCTGGTCTCGAGGATATCCTGCAGTTGG CTATCTATGGACGTCCAGCTGGGTTCGCCTGTAGTGGTAGTAGTGGTAAGACCAGAGCTCCTATAGGACGTCAACC;第10页/共102页;Sequence Inserted into OmpC L7;Expression of OmpC-(6His)n at 30?C;Expression of OmpC-(6His)n at 25?C;Interaction Between Neighboring Histidines and Ni-NTA Agarose ;Ni-NTA-Agarose Surface bound cells of (a) MC4100(pTCHP2) and (b) MC4100(pTCHP3);Attachment to Ni-NTA-Agarose beads;All recombinant cells could attach to the surface of Ni-NTA-Agarose;Cd2+ Adsorption of MC4100(pTCHPn);三、S-层蛋白用于表面展示;细菌表面S-层 ;一、S-layer 的分布;S-层可在细胞生长的所有阶段完全覆盖在细胞表面;G- 古细菌;第24页/共102页;a. 嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius(古细菌); b. 杀鲑气单胞菌(G-); c. 苏云金芽胞杆菌(G+)。PM, 质膜; PG,肽聚糖层；OM, 外膜；CW, 细胞壁；S, S-层。内标50nm。;;炭疽芽胞杆菌 Sap蛋白由814aa组成含N-末端29aa信号肽，其SLH位于N-末端200aa以内，通过该SLH已使聚蔗糖果聚糖酶成功地在细胞表面得到表达其表达的分子数与细胞表面S-层中S-层蛋白的分子数相当 ;四、S-层的应用前景;4. S-层在纳米材料方面有巨大应用潜力 S-层可作为形成有序排列的纳米金属或半导体材料的模板; 这些具有特殊物理性质的材料可广泛用于纳米电子学和非线性光学的研究;第三部分 利用S-层蛋白进行表面展示 的基因操作;苏云金芽胞杆菌;伴胞晶体;;测定 CTC 蛋白 ( ~ 100kDa ) 第一次：A G K S F P D V P A D H W G I 第二次：A G K S F P D V(P)A ;Digested CTC DNA with various restriction enzymes;Restrict location of ctc gene;E.coil X-Blue (pBMB982) 重组E.coil 生长艰难 易于自溶;表达S-layer蛋白的E.coli;;???一个来自苏云金芽胞杆菌的S-层蛋白基因 (Sara et al, J. Bacteriol, 2000); 3141 ATTAAAGAAG TAAAAGAAGT AAAATAATAA TTATTAAAGC I K E V K E V K - - 3181 CTATGAGAAA ATAGACAAAA GTCTATGAGT ATCATAGGCT 3221 TTTTATTTTG ATCTTATTTC ATATATATTT TAGATTGAAG ;;X 281;;ClaI 2.9kb in pKS ;;Problem 1 ;ATCGATCGTGCTTCTGCAGCTGTAATCTTCAC;GM2163: dam- dcm- VJS987: dam-;;实际使用pIJ2925;ATCGAT TAGCTA;ATCGACCGGCATGCAAGCTT TAGCTGGCCGTACGTTCGAA;ATCGA CAAGCTT TAGCTGGCC