《当归配方颗粒PCR鉴别》.pdfVIP

当归配方颗粒PCR 鉴别 1 范围 本文件规定了使用聚合酶链式反应 （PCR）鉴别当归配方颗粒的通用方法和要求。 本文件适用于当归配方颗粒的鉴别。 本文件不适用于正伪混合样品的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 T/CACM 1027.2—2016 中药分子鉴定通则 第 2 部分：中药提取物与中成药 中华人民共和国药典 （四部） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 当归配方颗粒 Danggui peifangkeli 为伞形科植物当归 Angelica sinensis (Oliv.) Diels 的干燥根经炮制并按标准汤剂的主要质量 指标加工制成的配方颗粒。 4 仪器设备 仪器设备应符合附录A 的要求。 5 试剂试药 试剂试药应符合附录A 的要求。 6 鉴别引物序列 Danggui-224F：5- CTCGTGGAGCTGTACTGGTA -3 1 Danggui-224R：5-GGTAGTCCCGCCTGACCT -3 7 检验程序 7.1 基本要求 为防止交叉污染，收样、取样、粉碎、DNA 提取和核酸扩增与产物检测应在不同操作间或在同一操 作间不同隔离区域进行，进入各区域应严格按照单一方向进行，即样品制备区→核酸制备区→扩增区 →检测区。 7.2 取样 送检样品总量应不低于 10 g，每批分为 3 等份，1/3供实验室分析用，另 1/3供复核用，其余 1/3 留样保存。收样时应检查包装的完整性，并在样品袋上贴上标签，填写采集数据表。对商品包装和送 样说明进行拍照记录，照片随样品一起备档。送检样品抽样方法依照《中华人民共和国药典》（四部） 通则 0211 进行取样。 7.3 DNA 提取 送检样品 DNA 提取步骤如下： a) 取样品 1 g，粉碎成粉末； b) 取上述粉末 0.02 g，置 2 mL 离心管中，加入细胞核裂解液 300 μL、乙二胺四乙酸二钠溶液 50 μL、蛋白酶 K 溶液 20 μL、RNA 酶 A 溶液 5 μL，充分涡旋震荡混匀 3 min，56℃下水浴 60 min； c) 离心（12000 ×g） 5 min 后，吸取上清液 250 μL至一新的 2 mL 离心管中，加入裂解缓冲液 250 μL，混匀，转移至纯化柱，将纯化柱放入离心机，离心（12000 ×g）5 min，弃去滤过液； d) 往纯化柱中加入洗脱液 700 μL，离心（12000 ×g）1 min； e) 重复步骤 d）2 次； f) 弃去滤过液，再离心（12000 ×g）2 min，取出纯化柱，室温放置 2 min，晾干吸附材料中的 剩余洗脱液； g) 将纯化柱换入一个新的2 mL 离心管，向吸附膜的中央悬空滴加无菌双蒸水 100 μL，静置 3 min， 离心（12000 ×g）2 min，取滤过液的上清液，作为供试品溶液，可置-20 ℃下保存备用。 除上述方法外，也可用等效的DNA 提取方法提取试样 DNA。 7.4 PCR 扩增 7.4.1 一般要求 首次使用本方法时，应校对 PCR 仪温控准确性，并使用阳性对照和阴性对照以核对使用的 Taq DNA 聚合酶或 PCR 预混液的适用性。 7.4.2 对照试验 送检样品应平行检测 2 次，并设置阳性对照（使用当归对照药材，按 7.3 提取 DNA，所获的液体作 为 PCR 扩增的阳性对照）、阴性对照（可选择白芷对照药材，按 7.3 提取 DNA，所获的液体作为PCR 扩 2 增的阴性对照）和空白对照。 7.4.3