实验专题模块二基质金属明胶酶与肿瘤的关系.pptxVIP

实验专题模块二基质金属明胶酶与肿瘤的关系第1页/共26页第2页/共26页实验专题模块二基质金属明胶酶与肿瘤的关系第3页/共26页肿瘤转移（Tumor Metastasis）是指肿瘤细胞脱离原发生长部位，通过各种途径的转运，在机体内远离原发部位的器官/组织继续增殖生长，形成转移瘤的过程。大体包括以下步骤：1）原发灶肿瘤细胞大量增殖，新生血管生长；2）肿瘤细胞从原发灶脱落，侵袭细胞外基质与基底膜，进而侵入血管、淋巴管或体腔。在这过程中，肿瘤细胞会分泌包括基质金属蛋白酶在内的多种酶类；3）极少数肿瘤细胞在循环系统中存活，形成癌栓，随血流、淋巴流迁移到另一远隔部位或器官；4）肿瘤细胞与靶器官的毛细血管壁发生黏附，穿出血管形成微小转移灶，细胞增殖并产生新的血管，形成与原发肿瘤性质一致的继发瘤，肿瘤细胞可以发生二次侵袭和转移。第4页/共26页ACDB肿瘤细胞的侵袭移动肿瘤细胞侵袭是指肿瘤细胞粘附并穿越细胞外基质，包括三个重要的步骤：粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，细胞经缺口移动。肿瘤细胞对周围组织和血管的侵袭是肿瘤细胞转移的关键步骤。转移的肿瘤细胞在原灶外存活和增殖，这是癌症对人类生命的最大威胁。第5页/共26页基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMPs）是一类依赖金属离子锌（Zn2＋)，并以细胞外基质组分作为底物的蛋白酶。MMPs家族已分离鉴别出26个成员，编号分别为MMP1～26。根据作用底物以及片断同源性，将MMPs分为6类，为胶原酶、明胶酶、基质降解素、基质溶解素、Furin活化的MMPs和其他分泌型MMPs。MMPs蛋白由多个结构域组成：1）N端有一段17~29个残基，富含疏水氨基酸的信号肽，所以这类蛋白均为分泌蛋白；2）后面是大约80个氨基酸组成的前肽，保守序列PRCGVPNPD中的半胱氨酸对酶原形式的维持至关重要；3）催化结构域由160～170个残基组成，含有高度保守序列HEXGHXXGXXH（X表示任意的氨基残基），其中的3个组胺酸与活性中心的锌离子结合；4）除了MMP-7、MMP-23和MMP-26外，其他MMPs的C末端都有一个类血红素结构域，参与大分子底物的识别以及与组织金属蛋白酶抑制剂（Tissue Inhibitors of Metalloproteinases，TIMPs）的结合。 第6页/共26页MMPs蛋白以酶原形式分泌，当机体需要时被其它蛋白酶水解分裂而激活。在生理pH值环境中，能够降解细胞外基质成分，参与细胞外基质重建，调节细胞黏着，直接或间接参与胚胎发育、组织再塑及创伤修复等正常生理功能。并在多种疾病病理过程中发挥作用，如炎症反应、恶性肿瘤浸润、动脉粥样硬化、脑血管病和多发性硬化等。 在肿瘤的侵袭转移中，较重要的有MMP-2与MMP-9等第7页/共26页MMP-2又称为明胶酶A，其基因位于人类染色体16q21，主要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生。以相对分子质量为72kDa的酶原形式分泌后，N端裂解掉80个氨基酸成为相对分子质量为66Da或62Da而被激活为活化型MMP-2；MMP-9又称为明胶酶B，其基因位于染色体20q12-q13，主要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产生。以前酶原（相对分子质量为78～82Da）的形式合成，后经裂解掉19个氨基酸的信号肽，再糖基化而转变成相对分子质量为95Da的酶原形式，酶原降解掉N端73个氨基酸产生此酶的活化形式（相对分子质量为84kDa）。本专题实验中，我们将用明胶酶谱法检测一系列肿瘤患者以及对照正常人血清中MMP-2与MMP-9的活性，以探讨其在肿瘤患者血清中的表达水平，从而加深同学们对肿瘤侵袭转移过程的认识。第8页/共26页实验 酶谱法分析食管癌中MMP-2与MMP-9活性一、实验目的掌握酶谱法测定MMP-2与MMP-9活性的原理熟悉酶谱法操作技术了解测定MMP-2与MMP-9活性的意义第9页/共26页酶谱法是酶活性的测定方法之一。酶活性的大小通常由酶降解底物的速度与程度决定。酶谱法将酶的底物均匀地铺在聚丙烯酰胺凝胶内，先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后创造酶作用的适宜环境，使酶恢复活性，在凝胶上降解底物。该凝胶通过染色，可呈现酶作用的痕迹。比较不同样品该痕迹的大小，可知酶活性的差异。二、背景与原理第10页/共26页（一） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳 带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。ν质点移动速度，q质点所带净电荷量，E为电场强度，r为质点半径，η为介质粘度。第11页/共26页催化剂+丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰氨凝胶电泳 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N′-甲叉双丙烯