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四 细胞融合原理 1细胞膜的结构与功能 细胞膜磷脂分子 扰动出现通道 ——细胞桥 当前第31页\共有84页\编于星期四\21点 主要环节 (1)亲本选择(单细胞或原生质体制备) (2)两原生质体或细胞互相靠近,粘附 (3)质膜融合形成细胞桥 P133 图7.4 (4)胞质渗透 (5)细胞核融合 (6)融合细胞筛选 当前第32页\共有84页\编于星期四\21点 原生质体及其制备 (1)定义: 去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生质体 (protoplast)。 (2)特点: 无细胞壁,可以方便地进行遗传操作、人工诱变 、细胞器转移、细胞融合等操作。 具有全能性,能再生细胞壁。 当前第33页\共有84页\编于星期四\21点 ( 3)制备与纯化 酶解法的建立 1960年,英国科金第一次采用 酶方法从番茄幼苗大量制备出 原生质体。使植物细胞融合技 术得以建立。 植物细胞的细胞壁主要成分是 纤维素(纤维素微纤丝 Cellulose microfibrils )、 果胶(pectin)、多糖 (glycan)。 果胶酶、纤维素酶等处理植物 组织,可以破坏胞间层和去掉 细胞的纤维素外壁,得到游离 的裸露原生质体。 当前第34页\共有84页\编于星期四\21点 4 分离 分离方法 飘浮法:常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll等。 离心法:低速离心,收集沉淀。 结合法:先低速离心,再漂浮 Percoll分层液:是经过聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinyl pyrolidone, PVP) 处理的硅胶颗粒混悬液,对细胞无毒性和刺激性。 当前第35页\共有84页\编于星期四\21点 关键: 细胞核的融合 若是没发生细胞核的融合,仅发 生了细胞质的融合,则可能成为 嵌合细胞。 含有多个核的异核细胞合并后形 成的单核细胞称为合核细胞。 细胞核的合并发生在有丝分裂过 程中。但是这种有丝分裂只有当 两个核的DNA合成基本同步时才 能发生:两个核同时进行有丝分 裂,形成一个纺锤体,全部染色 体都排列在一个赤道板上,结果 伴随着细胞分裂就形成了单核的 子细胞,其细胞核中含有双亲细 胞的染色体。 当前第36页\共有84页\编于星期四\21点 五 细胞融合方法 1.生物法 病毒诱导细胞融合:研究最早的细胞融合诱导方法。主要是由于 病毒会与宿主细胞膜直接融合,同时进入两个细胞就会打破两个 细胞膜的隔阂,引发细胞质的交流,进而达到细胞融合的目的。 原因可能是病毒的磷脂外衣与动物细胞膜相似,病毒外壳上的某 些糖蛋白有促进细胞融合的功能。 仙台病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙台病毒( HAJ)是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA与蛋白质的复合体。因 HAJ病毒毒力弱,易被灭活而常采用。 缺点:要提前大量培养病毒,并且灭活后才能作为融合剂使用, 操作繁琐,而且一旦灭活不充分的话,病毒还可能感染操作者与 亲本细胞。因此,目前已经很少使用病毒诱导法进行细胞融合。 当前第37页\共有84页\编于星期四\21点 原理与过程 (1)足够量的病毒颗粒附着在 细胞膜上起搭桥作用,使细胞 聚集在一起。 (2)通过病毒与原生质体或细 胞膜的作用使两个细胞膜间互 相渗透,胞质互相融合。粘结 部位质膜被破坏,不同细胞间 形成通道,细胞质流通并融合 (病毒也随之进入细胞质)。 (3)有丝分裂,细胞核融合, 形成杂种细胞。 当前第38页\共有84页\编于星期四\21点 2化学法 可以采用的化学诱导剂包 括: NaNO3、高pH的高浓度Ca2+ 离子、聚乙二醇(PEG) 、溶菌酶、明胶、抗体、 植物凝血素伴刀豆球蛋白 A等。 细胞膜电荷平衡被打破。 当前第39页\共有84页\编于星期四\21点 ( 1) NaNO3诱导融合 1909年,凯斯特(Kuster)发现机械分离的发生 了质壁分离的洋葱表皮细胞原生质体在NaNO3溶 液中可以恢复并伴随着细胞融合。 1972年,卡尔森(Carlson)利用NaNO3诱导融 合了粉兰烟草和郎氏烟草原生质体,培育出世界 第一株体细胞杂种。 NaNO3的钠离子可以中和原生质体表面负电荷, 引起原生质体聚集,促进细胞融合。NaNO3对原 生质体无损害,但融合效率低,一般小于4%。 当前第40页\共有84页\编于星期四\21点 ( 2)高pH的高浓度Ca2+离子诱导融合 1973年,凯勒(Keller)和梅尔切斯(Melchers) 发现采用强碱性(例如pH10.5)的高浓度钙离子溶 液(50mmol/LCaCl2?2H2O)在37℃下处理两个品系 的烟草叶肉原生质体,很容易促使融合,融合率可 以达到10%。 钙离子中和原生质体膜或细胞膜表面电荷,使 彼此紧密接触,决定质膜的稳定性和可塑性;高pH 能
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