基因编辑的学习材料.pptxVIP

基因编辑的学习材料第1页/共19页 1. 诞生背景全基因组测序技术的不断发展和完善+大型基因组注释项目的实现基因革命（转化医学、精准医疗）2将大量数据转化为功能和临床相关知识需要有高效、可靠的方法确定基因型如何影响表型同源重组优点：定向失活，准确。缺点：插入目标位点的效率低 筛选过程费时费力 有可能产生不利的突变效应RNAi基因靶向抑制技术优点：快捷、廉价、高通量缺点：效果不够彻底，影响因素众多 不可预知的脱靶效应基因编辑技术（近十年出现）:对各种细胞和各种生物体内的几乎任意基因进行人工操作第2页/共19页 2.1 基因编辑定义 基因编辑，是指对DNA核苷酸序列进行定点修饰（删除和插入等操作）的一项技术，该技术可精确剪断靶DNA片段并插入新的基因片段，既可模拟基因的自然突变，又能修改、编辑原有基因组，真正实现“编辑基因”。3第3页/共19页 2.2基因编辑原理（一）DNA修复系统主要通过两种途径修复DNA双链断裂,即非同源末端连接（Nonhomologous end joining, NHEJ）和同源重组（homologous recombination, HR）。 通过这两种修复途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造的目的，即基因敲除，特异突变的引入和定点转基因。4第4页/共19页 51）基因敲除：如果想使某个基因的功能丧失，可以在这个基因上产生DSB，NHEJ修复的过程中往往会产生DNA的插入或删除（indel），造成移码突变，从而实现基因敲除。2）特异突变引入：如果想把某个特异的突变引入到基因组上，需要通过同源重组来实现，这时候要提供一个含有特异突变同源模版。正常情况下同源重组效率非常低，而在这个位点产生DSB会极大的提高重组效率，从而实现特异突变的引入。3）定点转基因：与特异突变引入的原理一样，在同源模版中间加入一个转基因，这个转基因在DSB修复过程中会被拷贝到基因组中，从而实现定点转基因。第5页/共19页 2.2基因编辑原理6（二）人工构建或寻找一个内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的，如锌指蛋白（ZNF）、类转录激活因子（TALEN）、Cas蛋白等。所有基因编辑系统关键组成部分：1、DNA识别域2、核酸内切酶第6页/共19页 3、发展历程7 第一代：锌指核酸内切酶（zinc finger endonuclease, ZFN )，可将锌指蛋白与核酸内切酶Fok I融合形成的核酸内切酶，利用它可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA的双链切口。DNA识别域：由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3~4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。核酸内切酶： 非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA。第7页/共19页 TALEN第二代：类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALEN)， TALEN可以和ZFN一样可对复杂的基因组进行精细的修饰，同时其构建较为简单，特异性更高，因此受到了科研工作者的青睐。8DNA结合结构域：TALE蛋白是由一连串33~35个氨基酸组成的重复结构域组成的，其中每一个结构域都能够识别一对碱基该区域主要由两个高度可变的氨基酸决定，被称作重复可变双氨基酸残基位点（repeat-variable?di-residues,?RVD）。与锌指结构域一样，这种TALE重复模块也能够串联起来，识别一长串的DNA序列。核酸内切酶： 非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA第8页/共19页 全长为34aa的Tal 蛋白的第12、13位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基。 NG可以识别T HD可以识别C NI可以识别A NN可以识别G或A通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组装在一起，再加上Fok I核酸内切酶，就可以构成可以识别目的片段的Tale蛋白。TALEN原理9第9页/共19页 TALEN的特异性打靶的原理：一对可以特异性识别靶基因的TALE，定位到需要编辑的基因组区域；然后非特异性核酸内切酶FokI切断双链DNA从而造成DNA双链断裂（double-strand break，DSB）；再通过DNA的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。FokI只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。TALEN原理10第10页/共19页 TALEN介导的基因编辑TALEN质粒对共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个TALEN融合蛋白中的Fok I临近，形成二聚