血红蛋白的提取(好.pptxVIP

第1页/共39页血红蛋白的提取(好第2页/共39页 一、基础知识蛋白质分离的原理： 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。第3页/共39页阅读P64回答：1、凝胶色谱法利用的是蛋白质的哪个性质？2、该方法中哪种物质是关键？如何起到分离作用？第4页/共39页（一） 凝胶色谱法1.原理：2.凝胶： 大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。第5页/共39页3.凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程①______________ 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较___，移动速度较____;②_______________的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较___，移动速度较____。相对分子量较小长慢相对分子量较大短快第6页/共39页第7页/共39页 （二）缓冲溶液1.作用:2.组成：如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等3.缓冲溶液的配制:4.在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？第8页/共39页 （三） 电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。第9页/共39页阅读P66回答1、电泳方法有哪些？本书采用的是哪种？2、SDS的作用？第10页/共39页类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。第11页/共39页电泳电泳检测结果第12页/共39页第13页/共39页1、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较第14页/共39页3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少B 分子的大小C 肽链的多少D 分子形状的差异第15页/共39页水 分血浆固体物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血液白细胞血细 胞两个α－肽链血小板血红蛋白（90％）两个β一肽链红细胞（最多）四个亚铁红素基团 二、实验操作蛋白质提取和分离步骤样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定（一）血红蛋白血液有哪些成分？第16页/共39页每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。两个α－肽链血红蛋白两个β一肽链四个亚铁血红素基团血红蛋白的特点：第17页/共39页 用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。第18页/共39页（二）操作过程1.样品处理及粗分离(1)红细胞的洗涤:①洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。②洗涤操作：1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。第19页/共39页(2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色)；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。第20页/共39页(4)透 析： ①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。 ②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。第21页/共39页2.凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱的制作： ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置