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酵母基因工程详解;真菌基因工程;一、真菌表达系统的优缺点;二、酵母转化系统
;1、酵母宿主系统; 用作模式真核生物的酵母宿主菌;用作外源基因表达的酵母宿主菌;抑制超糖基化作用的突变宿主菌;提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌;减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌;减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌;减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌;人工构建质粒: 5种
酵母附加型质粒(YEp)
酵母复制型质粒(YRp)
酵母着丝粒质粒(YCp)
酵母人工染色体(YAC)
酵母整合型质粒(YIp);酿酒酵母中的2μ环状质粒;含有大肠杆菌质粒的复制元点,以便克隆操作
含有一定数量供克隆操作的单一酶切位点
含有在酵母和大肠杆菌中进行选择的双标记
除YIp型质粒外均为穿梭载体
;YEp质粒;YRp质粒;YCp质粒;YAC质粒;YIp质粒;3 用于酵母转化子筛选的标记基因; 宿主细胞:为氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变子
主要有:LEU-、TRP-、HIS-、URA-
载体:携带相应的合成基因
如:leu1/leu2、trp1、his3/his4 、ura3
选择压力:不完全培养基
如:YNB、无机盐培养基; 显性标记基因的编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白;4 酵母菌转化方法;酵母菌原生质体转化法;碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化;酵母菌电击转化法;5 外源DNA在酵母宿主细胞中的命运;三 酵母表达系统;(一) 酿酒酵母表达系统;1、酿酒酵母启动子;1)糖酵解途径中关键酶的强启动子,受葡萄糖诱导:
甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH
磷酸甘油激酶基因PKG
乙醇脱氢酶基因ADH;2)半乳糖激酶启动子(GAL1);2)半乳糖激酶启动子(GAL1);3)pho4TS-PHO5启动子;酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源:
性结合因子:MF-α
酸性磷酸酯酶:PHO5
蔗糖酶:SUC2
杀手毒素因子:KIL
;*保守性低,大多异源宿主系统的信号肽不能互用
*信号肽结构:
;*分泌效率高
*在酵母系统具有通用性
*88个残基组成
;糖基化位点:Asn-X-Thr/Ser(X代表任何氨基酸)
N-型糖基化:???门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖
基化,对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。
O-型糖基化:苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化 ;* 过糖基化(超糖基化修饰):
N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活性与药代稳定性均有影响。
*糖链组成
O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸基团;1)表达水平普遍不高
A、表达载体传代不稳定(YEp、YRp)
B、所采用的强启动子调控不严谨
C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵
2)分泌表达产物过糖基化;酵母菌表达系统的选择;酵母菌表达系统的选择;酵母菌表达系统的选择;酵母菌表达系统的选择;F 利用重组酵母生产乙肝疫苗;F 利用重组酵母生产乙肝疫苗;乙型肝炎病毒的结构与性质;乙型肝炎病毒的结构与性质;乙型肝炎病毒的结构与性质;产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母;;谢谢观看!
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