核酸生物化学实验技术实验.pdfVIP

核酸生物化学实验步骤 （一）酵母中RNA 的提取及紫外分光光度法测定核酸浓度 1．稀碱法提取酵母中RNA 实验原理：基于核酸不溶于乙醇。先用稀碱将酵母细胞裂解，采用酸中和，通过离心去除菌体 细胞的大碎片，采用乙醇可将上清液中的RNA 沉淀出来。该方法提取的核酸分子为变性失活 的RNA 。 操作方法： （1）称取2 g 干酵母粉，放入 100 mL 烧杯中，加入20 mL 的1%氢氧化钠水溶液，搅拌30 min （玻璃棒手动充分搅拌）。 （2 ）30 min 后，向（1）中加入少量乙酸调节pH 至中性（切忌调节pH 低于3， RNA 的等电 点2-2.5 ），试纸检查。 （3 ）将（2 ）全部转移至离心管中，3800 rpm 离心10 min （最大装液量离心管体积的三分之二， 等分两个离心管进行离心）。弃沉淀（主要是细胞壁等碎片），留上清（含有RNA ）。 （4 ）将上清液转移至干净的100 mL 烧杯中，加入 15 mL 95% 的乙醇，充分混匀，静置10 min 。 （此时，大部分RNA 沉积于烧杯底部，转移时需要搅动，以免丢失RNA 。因此该步骤也可将 上清液直接转移到离心管，静置10 min 是必要的） （5 ）将（4 ）转移至离心管，3800 rpm 离心5 min （一次离心管装不下，分两次离心），弃掉上 清液，用95% 乙醇重悬，离心洗涤2 次，每次95% 乙醇用量5 mL 。 （6 ）将洗涤后的样品转移至干净的表面皿（已称重）上，95℃水浴蒸汽干燥（约10 min 左右）， 称重计算干酵母中RNA 含量。 提取的RNA 重量（g ） ( ) 干酵母中RNA 含量 % = × 100% 干酵母重量（g ） 2 ．紫外吸收法测定提取RNA 干粉中核酸含量 实验原理：核酸分子在260 nm 处具有特异性吸收峰 试验方法： （1）称取实验1 中提取的RNA 干粉20 mg ，加入少量0.5 mol/L 的氢氧化钠水溶液溶解，然后 加入去离子水，用50 mL 容量瓶定容， （2 ）以去离子水做空白，测260 nm 处的吸光度（A ），计算提取的RNA 干粉中核酸含量。 ∆A260 （g ）× V ( ) RNA 中核酸含量 μg/g = × (/) 0.024 × L × m 其中： ∆A260为RNA 溶解液在260 nm 处的吸光度; L 为比色皿的光程（1 cm ）; N 为稀释倍数; 0.024 为1 mL 溶液中含有1 μg RNA 的260 nm 处吸光度; V 为RNA 溶解液的体积（mL ）; m 为RNA 溶液中RNA 质量（g ）; 备注： 文献报道的酵母中RNA 含量为2.67~10% ，DNA 含量为0.03~0.516% ； 乙酸具有刺激性气味，调节pH 取用需小心； RNA 干粉较难溶解，需用玻璃棒充分搅拌； 稀碱处理液离心结束后转移上清液时切忌将沉淀转移到烧杯中（影响核酸浓度）； 预实验提取酵母中RNA 含量均值3.29%； 紫外分光光度计测量A260 时，如果吸光度过大，需用去离子水稀释处理，保证吸光度在0.2~0.8 。 （二）质粒DNA 琼脂糖凝胶电泳 1. 琼脂糖凝胶电泳 1) 20 ml 的1×TAE 缓冲液中加入0.2 g 琼脂糖（浓度为1%），摇匀，微波炉加热（注意！防止 突沸及胶液外溢）或沸水浴加热溶化； 2) 待手持胶液不烫手时（约50 ℃），加入2 μ l 荧光染料Goldview，混匀，倒入有机玻璃槽内， 插上齿梳使之