凝胶层析法分离不同分子量物质实验.pdfVIP

凝胶层析法分离不同分子量物质实验.pdf

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凝胶层析法分离不同分子量物质 实验步骤: 1 ,凝胶准备(已准备):称取交联葡聚糖 G-100 1g,置于锥形瓶中, 加蒸馏水30ml ,于沸水中煮沸1h 取出,待冷却至室温再进行装柱。 2, 装柱 (已准备):取直径 1cm,长度20cm 层析柱垂直地安装好。 将已经溶胀的凝胶沿着玻璃棒小心的徐徐灌到胶中,尽量一次倒完避 免出现断层,如不能一次倒完,用玻璃棒搅拌上层凝胶,再继续加入 剩下的凝胶。待凝胶沉淀压实后,再在凝胶上面加1-2ml 的水,将胶 面压平。 3 ,样品的制备 (已准备) (1)血红蛋白的制备 称取牛血红蛋白0.2g,充分溶解于10 ml PBS 缓冲液中 (超声促进 溶解),冰箱备用。 (2)核黄素(维生素B )的制备 2 称取核黄素 0.1g,充分溶解于10 ml 稀NaOH 溶液中,冰箱备用。 (3)蓝色葡聚糖2000 的制备 称取蓝色葡聚糖2000 0.1 g,充分溶解于蒸馏水中,冰箱备用。 (4)层析混合样品制备 取血红蛋白溶液 0.3 ml,核黄素溶液 0.1 ml,蓝色葡聚糖2000 0.1 ml,充分混匀作为样品。 4 ,加样 加样时先将柱子接上蠕动泵(另一端不接洗脱液),使柱床表面的 蒸馏水流出,直至床面正好露出,关闭蠕动泵 (或用胶头滴管将柱床 面多余水吸出,注意滴管不要碰到柱床面)。用移液器将上述样品(约 0.5 ml)缓缓沿层析柱内壁小心加于床表面,注意尽量不要使床面搅 动。待样品进入床内,直到床面积重新露出,再在柱上面加 1-2ml 的蒸馏水 (用胶头滴管沿柱子内壁旋转加入),蠕动泵的另一端接上 洗脱液,用水进行洗脱。 5 ,洗脱 将蠕动泵一端接洗脱液一端接柱子,控制流速为1ml/min (蠕动泵 数值200 左右),进行洗脱,柱子上端接蠕动泵,下端接部分自动收 样器,进行收集,1 分钟收集1 管,每管大约1ml。 6, 观察 观察样品在层析柱中色带位置及洗脱顺序,计算样品的洗脱体积。 实验结果分析: 洗脱顺序:蓝色葡聚糖2000 血红蛋白 核黄素 红色血红蛋白 洗脱体积:计算从加样到样品洗脱下来流出的总体积。 存在问题:红色血红蛋白颜色特别浅。

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