第四章细菌的分型及其检测技术.ppt

“敏感”（sensitive，S）：表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制； “耐药”（resistant，R）：表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无效。 “中介”（intermediate，I）：表示测试菌对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株，使用高于正常给药量有疗效。 * 第三十页，共六十七页，2022年，8月28日 （五）质量控制 采用质控标准菌株和测试菌在同一条件下做药敏试验，质控菌株的抑菌圈在允许范围内，结果可信。 目的：检查试验条件（如培养基、含药纸片和接种菌量）、操作技术等是否合格 质控标准菌株：大肠杆菌ATCC 25922、粪肠球菌ATCC 29212、金黄色葡萄球菌ATCC 25923等 * 第三十一页，共六十七页，2022年，8月28日 稀释法是体外定量测定抗菌药物抑制细菌生长活性的方法，所获结果比较准确，常被用作校正其他方法的标准。 原理是用一系列不同浓度的药物与等量细菌作用，找出能抑制细菌生长的最低浓度或杀灭细菌的最低浓度，其结果用最小抑菌浓度 (MIC) 或最小杀菌浓度(MBC)表示P101。 分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。 三、稀释法 * 第三十二页，共六十七页，2022年，8月28日 肉汤稀释法 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 * 第三十三页，共六十七页，2022年，8月28日 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 * 第三十四页，共六十七页，2022年，8月28日 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 * 第三十五页，共六十七页，2022年，8月28日 特殊性：结核分枝杆菌生长缓慢，在细菌生长之前药物已扩散而无法影响细菌的生长。 方法：绝对浓度法、比例法、放射测量法等。 绝对浓度法:是我国实验室普遍使用方法。将浓度递减的药物与等量培养基混合制成含药培养基，不含药培养基为对照，分别接种待测菌和标准菌，培养4w，菌落数多于20个为阳性（据此判定MIC）。受试菌与标准菌MIC的菌落数比值≤2判为敏感，≥8为耐药。 比例法：WHO、国际防痨和肺病联合会推荐的标准方法。将不同稀释度的待测菌接种于相同浓度的含药培养基，检测耐药性。 四、结核分枝杆菌药敏试验 * 第三十六页，共六十七页，2022年，8月28日 一、核糖体分型 二、脉冲场凝胶电泳分型 三、序列分型 四、多位点序列分型技术 第四节 分子生物学分型技术 * 第三十七页，共六十七页，2022年，8月28日 实质：核酸探针杂交分型技术。 核糖体RNA（rRNA）基因最为保守，在基因组上存在多个拷贝，以rRNA基因片段为探针，检出含有rRNA基因的DNA片段，通过分型杂交后的rRNA指纹图，进行菌种分型和近源菌株的鉴定。 原理：样本DNA经酶切消化，凝胶电泳分离片段，转印到膜上进行Southern印迹杂交分析。以rRNA基因片段为探针，杂交产生菌株特异性的DNA指纹图，与平行样本或数据库进行比对达到分型目的。 一、核糖体分型 * 第三十八页，共六十七页，2022年，8月28日 * 第三十九页，共六十七页，2022年，8月28日 实验过程 探针的设计：一般以16S rRNA和23S rRNA作为探针，现已商品化 菌体的分离培养与DNA提取 菌体DNA酶切及电泳 Southern 印迹杂交 全自动微生物核糖体基因分型系统。 优点是高效简便、快速、以标准化；缺点是费用高。 * 第四十页，共六十七页，2022年，8月28日 脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术是细菌分型较灵敏的方法，通过检测染色体上所有酶切位点的变化，反映全部基因的相关性，提供可靠的基因分型依据。 优点：重复性好，分辨力强，是基因分型的“金标准”，在识别和追踪医院感染暴发和流行上具有实用价值。 与普通凝胶电泳区别：普通电泳分离DNA分子的上限是50Kb，而PFGE能分离10-800kb的DNA片段。 二、脉冲场凝胶电泳分型 * 第四十一页，共六十七页，2022年，8月28日 PFGE分型原理是将细菌包埋于凝胶块中，用溶菌酶和蛋白酶K消化菌体和蛋白质，释放完整的染色体DNA，采用稀有切点酶酶切DNA，产生有限数目的高分子量限制性片段。在特定的电泳系统中，定时改变电场方向，反复循环，使DNA在凝胶网孔中呈曲线泳动而得到分离，形成特定的电泳条带图谱。不同菌株的电泳图谱具有高度特异性，染色后目测形成的片段条带，而识别特异的菌株。 * 第四十二页，共六十七页，2022年，8月28日 * 第四十三页，共六十七页，2022年